“Inteligência Artificial: A Nova Fronteira da Ciência Brasileira”
19 a 24 de outubro de 2020
Trabalho 13558
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Agrárias |
| Área temática | Microbiologia |
| Setor | Departamento de Microbiologia |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Rafael Oliveira Rosa |
| Orientador | MARISA VIEIRA DE QUEIROZ |
| Outros membros | Leandro Lopes da Silva |
| Título | ISOLAMENTO DE MUTANTES PARA A NITRATO REDUTASE de Colletotrichum lindemuthianum, AVALIAÇÃO DA PATOGENICIDADE E CLONAGEM DO GENE nit1 |
| Resumo | O fungo Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose no feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.). A análise de mutantes com modificações em genes relacionados a patogenicidade é uma estratégia comumente empregada para a descoberta de proteínas essenciais para o desenvolvimento da doença. Para a aplicação da mutagênese insercional é importante o desenvolvimento de um sistema de transformação eficiente e barato. Sistemas de transformação que utilizam a complementação de mutações auxotróficas para a seleção das colônias transformadas são alternativas a seleção baseada na resistência aos antimicrobianos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema de transformação eficiente para C. lindemuthianum baseado na complementação de mutantes Nit1-. Para atingir este objetivo foram isolados mutantes espontâneos Nit1- e estes foram analisados quanto a patogenicidade. Também foi realizada a clonagem do gene nit1 de C. lindemuthianum em um plasmídeo. Para o isolamento dos mutantes, foram inoculados 1x107 conídios do isolado A2-2-3 (raça 89) de C. lindemuthianum, em placas de Petri contendo meio mínimo acrescido de clorato. A caracterização dos mutantes foi realizada em meio mínimo com diferentes fontes de nitrogênio, sendo elas: nitrato, nitrito, amônia e hipoxantina. No teste de patogenicidade, folhas de feijoeiro-comum da cultivar Pérola foram inoculadas com 1x106 conídios dos mutantes Nit1- com auxílio de pincel. O isolado selvagem foi utilizado como controle. Após 5 dias, os sintomas foram avaliados. Para a clonagem do gene nit1, o DNA do isolado selvagem foi extraído e o gene nit1 amplificado com a enzima Taq DNA polimerase de alta fidelidade. O produto da PCR foi utilizado para clonagem no vetor pZErO e a reação de ligação foi utilizada na transformação de Escherichia coli. Colônias que apresentavam os plasmídeos recombinantes foram identificadas por PCR e por clivagens do plasmídeo recombinante com diferentes enzimas de restrição. Ao todo, 52 mutantes foram obtidos e caracterizados, sendo 33 deles mutantes para o gene nit1. Os quatro mutantes Nit1- utilizados no teste de patogenicidade foram capazes de causar doença no feijoeiro-comum. Os sintomas da antracnose apresentados pelas plantas inoculadas com conídios dos mutantes e com os conídios do isolado selvagem foram semelhantes, demonstrando que a mutação no gene nit1 não afetou a patogenicidade. O gene nit1 foi eficientemente clonado no plasmídeo pZErO, que passou a ser denominado pNit1Cl. A obtenção dos mutantes e do plasmídeo transportando o gene nit1 é o primeiro passo para o estabelecimento de um sistema de transformação baseado em complementação de mutação auxotrófica. Este sistema poderá ser usado em estudos visando a inativação de genes relacionados a patogenicidade do fungo. |
| Palavras-chave | Nitrato Redutase, Mutantes Auxotróficos, Sistema de Transformação |
| Forma de apresentação..... | Painel |
| Link para apresentação | Painel |
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