"Ciências Básicas para o Desenvolvimento Sustentável"
24 a 26 de outubro de 2023
Trabalho 19227
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PIBITI/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG, FUNARBE, Outros |
| Primeiro autor | Livia Batista Galinari |
| Orientador | ANDREA DE OLIVEIRA BARROS RIBON |
| Outros membros | Bruno de Araújo Penna, Rosana Barreto Rocha, Thiago Freitas de Sá Coimbra, TIAGO ANTONIO DE OLIVEIRA MENDES |
| Título | Reversão da Resistência Antimicrobiana em Acinetobacter baumannii e Staphylococcus pseudintermedius Utilizando uma Plataforma Multiplex CRISPR-Cas9. |
| Resumo | Infecções causadas por bactérias multirresistentes são um grande problema de saúde pública, causando milhares de mortes a cada ano. Em particular, os altos níveis de resistência antimicrobiana da bactéria gram-negativa Acinetobacter baumannii aos carbapenêmicos têm aumentado exponencialmente, elevando o patógeno ao mais alto patamar de prioridade para o desenvolvimento de novos fármacos. A bactéria gram-positiva Staphylococcus pseudintermedius é responsável por infecções graves e necrotizantes em humanos e cães com resistência a antibióticos também detectada. Como a descoberta e o desenvolvimento de novos medicamentos são processos onerosos e demorados, alternativas para reverter a resistência, como o CRISPR-Cas9, são urgentes. O objetivo é desenvolver um sistema multiplex de CRISPR-Cas9 com capacidade de silenciar genes de resistência bacterianos e consequente re-sensibilização de isolados clínicos a antibióticos. Primeiramente foram construídos RNAs guia (sgRNAs) para dois genes alvo da família das OXA β-Lactamases, com base na sua prevalência no Brasil e relevância clínica. Posteriormente foi realizada uma análise de possíveis regiões off-target em 96 genomas de A. baumannii depositados em banco de dados. Em seguida, a fim de validar o sistema CRISPR-Cas9 nas duas espécies, três vetores foram utilizados. O primeiro expressa a proteína GFP com marca de seleção a Kanamicina. Outro induz resistência à Ampicilina, conferida pelo gene blaTEM, com expressão de RFP. O último possui marca de seleção para Cloranfenicol, além de todo cassete necessário para expressar um sistema CRISPR-Cas9 exógeno funcional, incluindo sítio para adicionar sgRNA visando o blaTEM ou qualquer outro gene alvo. Nove isolados clínicos de A. baumannii e uma cepa de S. pseudintermedius foram submetidos ao teste de concentração inibitória mínima frente aos antibióticos para caracterização do perfil de resistência. Com as cepas selecionadas, foram realizados testes de transformação para inserir o vetor GFP nas bactérias. As bactérias geneticamente modificadas foram selecionadas e a clonagem foi confirmada por PCR. Dos nove isolados clínicos de A. baumannii testados, apenas um foi suscetível aos três antibióticos. Os vetores GFP e RFP foram clonados com sucesso em A. baumannii, mas sem detecção de fluorescência, indicando que o promotor e RBS utilizado pode não ser eficiente para transcrição e tradução nesta bactéria. Já para S. pseudintermedius, foi validada a transformação do vetor RFP. Para a construção dos sgRNAs, das 917 regiões de alinhamento avaliadas, não foram identificados potenciais riscos de off-targets. Ademais, as regiões de alinhamento significativo foram confirmadas como pertencentes aos genes das OXA β-Lactamases alvo. Dessa forma, o sistema multiplex desenvolvido pode ser usado em bactérias gram-positivas e gram-negativas e o principal desafio é desenvolver um sistema baseado em vírus para entregar a plataforma CRISPR-Cas9 às bactérias resistentes in vivo. |
| Palavras-chave | resistência antimicrobiana, CRISPR-Cas9, re-sensibilização |
| Forma de apresentação..... | Vídeo |
| Link para apresentação | Vídeo |
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