"Ciências Básicas para o Desenvolvimento Sustentável"
24 a 26 de outubro de 2023
Trabalho 19025
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Agrárias |
| Área temática | Medicina veterinária |
| Setor | Departamento de Veterinária |
| Bolsa | PIBITI/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CNPq |
| Primeiro autor | Julia Cristine Dias Louzada |
| Orientador | FERNANDA SIMONE MARKS |
| Outros membros | Caio Augustus Diamantino, Fabio Assad Feres Rodrigues, Leonardo Teofilo Toledo, Luiz Fernando Lino de Souza |
| Título | Determinação da curva de crescimento dos isolados UFV01 e UFV02 de Mycoplasma hyopneumoniae por densidade óptica em espectrofotômetro, pH e qPCR |
| Resumo | Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) é o agente primário da pneumonia enzootica suína. O microrganismo é encontrado principalmente na superfície da mucosa da traqueia, brônquios e bronquíolos de suínos, porém seu cultivo e isolamento se caracteriza por ser fastidioso e de crescimento lento. A quantificação rápida e precisa e o entendimento da curva de crescimento bacteriano in vitro é de extrema importância para as práticas laboratoriais de pesquisa e industrial. As técnicas clássicas de quantificação, como a contagem padrão em placa e mensuração de turbidez não são empregadas para Mhyo devido as suas características de crescimento. Sendo assim, o objetivo é avaliar a curva de crescimento dos isolados UFV01 e UFV02 e a correlação de três técnicas: leitura por densidade óptica (DO) em espectrofotômetro, mensuração do pH, e qPCR. Para isto, foi preparado o meio Friis 1x contendo vermelho de fenol, e os isolados foram reativados seguido de três passagens sucessivas. Após a terceira passagem, os isolados foram diluídos em uma proporção de 1:20 (inóculo x meio Friis) em tubos tipo falcon no volume de 50 ml. Diariamente, durante 10 dias, foi retirado uma alíquota de 4 ml para mensuração do seguido de leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 550 λ. Para a qPCR, o DNA foi extraído de uma alíquota de 500μl das amostras utilizando Fenol-Clorofórmio e eluído em 50μl de água DNAse free. O DNA foi submetido a reação de qPCR, utilizando os primers sense5′-TAAGGGTCAAAGTCAAAGTC3′anti-sense5′AAATTAAAAGCTGTTCAAATGC-3′ e sonda 5′-FAM-AACCAGTTTCCACTTCATCGCC-§BHQ2−3’. A curva padrão foi construída a partir de uma clonagem com célula competente TOP10, sendo diluída de forma seriada de 109 até 101. A eficiência da reação de qPCR foi de 100 %; R2 de 0,994; e slope de -3,323. Para a reação foi utilizado 10μL de Master mix Go taq®; 1μL de cada par de primer; 0,6μL da sonda; 2,7μL de água e 2μL de DNA da amostra, totalizando 20μL. A reação se deu com desnaturação por 3 min a 95°C, 39 ciclos a 95°C for 15s e um ciclo de anelamento/extensão 55,7°C for 1 min. Os dados foram compilados pelo teste de Shapiro-Wilk para verificação de normalidade dos erros; e o teste de Levene, para verificação da homogeneidade de variâncias e posteriormente submetidos ao teste de correlação de Spearman. O pH do isolado UFV01 variou de 7,95 a 6,52, o número de cópias de DNA/μl foi de 9.13E+01 até 7.00E+07 e a DO foi de 1,805 para 0,415. Já para isolado UFV02, o pH foi de 7,94 para 657; o número de cópias de DNA/μl foi de 3.09E+03 para 3.09E+03 e a DO variou de 1,802 a 0,468. Os valores de correlação entre as variáveis pH x qPCR foi de -0,939 e -0,961; pH x DO foi de 0,973 e 0,982 e qPCR x DO foi de -0.925 e -0967, respectivamente para UFV01 e UFV02. Pode-se concluir que os isolados apresentam curva de crescimento semelhantes e de que as variáveis testadas apresentam alta correlação entre si. |
| Palavras-chave | Pneumonia, quantificação, curva padrão |
| Forma de apresentação..... | Painel |
| Link para apresentação | Painel |
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