"Ciências Básicas para o Desenvolvimento Sustentável"
24 a 26 de outubro de 2023
Trabalho 18261
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Microbiologia |
| Setor | Departamento de Biologia Geral |
| Bolsa | Outros |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | FUNARBE |
| Primeiro autor | Ana Paula de Paiva Lima |
| Orientador | SERGIO OLIVEIRA DE PAULA |
| Outros membros | Eleandro Fernandes Fouraux, John Willians Oliveira Prates |
| Título | Transformação da levedura Komagataella phafii com o vetor pPICZαA-ZIKV-EDIII |
| Resumo | A Zika é uma doença causada por um flavivírus, que pode ser transmitida pelos vetores Aedes aegypti ou Aedes albopictus, além de ter outras vias de transmissão. Geralmente causa sintomas leves e inespecíficos, mas, em alguns casos, pode gerar quadros graves, como microcefalia congênita e a Síndrome de Guillain-Barré. A Zika é uma doença de notificação compulsória, mas seus sintomas inespecíficos dificultam o diagnóstico, sendo necessários testes laboratoriais mais eficientes para confirmar a doença. Entretanto, o Zika vírus (ZIKV) tem muitas semelhanças com outros flavivírus, fazendo com que ocorra reatividade cruzada em vários dos testes utilizados, gerando dúvida mesmo com a utilização dos mesmos. Já foi verificado que o domínio III da proteína de envelope (EDIII) do ZIKV possui potentes epítopos antigênicos e imunogênicos, já tendo demonstrado grande especificidade para Zika, não gerando reatividade cruzada com os vírus da dengue, do Nilo ocidental e da febre amarela. Ele é, portanto, um bom candidato para o desenvolvimento de testes diagnósticos. Já para a produção de proteínas heterólogas, a levedura Komagataella phafii demonstrou-se eficiente, apresentando mecanismos de expressão semelhantes aos de mamíferos. Este trabalho tem como objetivo, portanto, a transformação da levedura K. phafii com o plasmídeo pPICZαA-ZIKV-EDIII, que possui, como inserto, o gene da proteína EDIII de ZIKV, para posterior expressão da mesma e utilização em testes diagnósticos. Como metodologia, inicialmente, o vetor pPICZαA-ZIKV-EDIII foi construído pela empresa GenScript e clonado na bactéria Escherichia coli, para sua propagação. Ela foi cultivada e seu DNA plasmidial foi extraído, purificado e linearizado. Para a transformação das leveduras, elas foram, inicialmente, cultivadas em meio YPD e, então, transformadas por eletroporação com o plasmídeo. Em sequência, as células foram plaqueadas em meio YPDS com 100 µg/ml do antibiótico zeocina e incubadas até o aparecimento de colônias. Como o plasmídeo possui um gene para resistência a esse antibiótico, ele é um bom marcador de seleção. As colônias que cresceram foram coletadas e o DNA genômico das leveduras foi extraído para a realização da técnica de PCR, a fim de confirmar a transformação. Foram usados primers para o promotor AOX1, presente na construção, e, em seguida, realizada eletroforese em gel de agarose 1%. A transformação foi confirmada pela presença de um amplicon de cerca de 1000 pb, altura esperada para a sequência alvo. Os próximos passos serão a produção da proteína pela levedura, seguido da sua aplicação no desenvolvimento de testes diagnósticos. |
| Palavras-chave | Expressão de proteínas, Zika vírus, Komagataella phafii |
| Forma de apresentação..... | Vídeo |
| Link para apresentação | Vídeo |
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