"Ciências Básicas para o Desenvolvimento Sustentável"
24 a 26 de outubro de 2023
Trabalho 18143
| ISSN | 2237-9045 |
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| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Bioquímica |
| Setor | Departamento de Biologia Geral |
| Bolsa | PIBIC/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Mylena Carvalho dos Santos |
| Orientador | LEANDRO LICURSI DE OLIVEIRA |
| Outros membros | Daniel Silva Sena Bastos, MICHELLE DIAS DE OLIVEIRA TEIXEIRA, SILVIA ALMEIDA CARDOSO |
| Título | Produção e avaliação do uso de enzimas não comerciais para diagnóstico da Covid-19 através da técnica de RT-LAMP. |
| Resumo | O novo coronavírus SARS-CoV-2 foi o responsável pela crise global na saúde acarretando mais de 6 milhões de mortes ao redor do mundo. O controle e prevenção da pandemia estão associados a testagem, que desempenha o papel de identificação de casos positivos, permitindo o isolamento, o seu rastreamento, quebrando a cadeia de transmissão, e permite um tratamento precoce, favorecendo a recuperação do paciente. Foram desenvolvidos diversos testes moleculares para o COVID-19, como a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que amplifica o material genético do vírus presente em uma amostra, entretanto os métodos moleculares que identificam o genoma e antígenos virais são caros, impossibilitando a realização em locais economicamente desfavoráveis e necessitam de mão de obra especializada, tornando o processo demorado. Diante dessas questões, a busca por um teste que seja sensível, acessível e rápido se tornou uma prioridade. Por apresentarem diversas vantagens, as técnicas de amplificação isotérmica, RT-LAMP foram empregadas para a realização de testes em locais de atendimento primário, proporcionando resultados em curto prazo. O objetivo desse trabalho é criar uma estratégia de baixo custo que atenda a maior parte da população utilizando as enzimas não comerciais Bst DNA-polimerase e a HIV-RT na técnica RT-LAMP. Inicialmente, os genes das enzimas Bst DNA-polimerase e HIV-RT foram clonados em plasmídeos pET24a e transformados em células competentes de E. coli BL21(DE3) por meio de choque térmico. As células transformadas foram incubadas em meio LB e depois plaqueadas em placas de Petri contendo meio seletivo contendo Ampicilina. As colônias resultantes indicam a expressão bem-sucedida das enzimas e uma colônia foi selecionada e cultivada em meio LB com ampicilina. A cultura foi diluída e induzida com IPTG para expressão das proteínas de interesse. Após a incubação, as células foram coletadas, lisadas e o sobrenadante contendo as proteínas foi purificado em uma coluna de níquel. Para avaliar a atividade da enzima Bst DNA-polimerase recombinante uma reação de LAMP utilizando usados seis pares de primers específicos para os genes ORFs N e E do SARS-CoV-2 foi realizada e à amplificação foi verificada pela alteração de coloração. Para avaliar a enzima HIV-RT, extraiu-se RNAse P de um esfregaço bucal, realizou-se uma PCR com os primers B3 e F3 e um ensaio de RT-LAMP. A padronização do RT-LAMP foi realizada através da avaliação por qRT-PCR de amostras de pacientes. As amostras foram inativadas, armazenadas e submetidas à reação de RT-LAMP com a adição de HIV-RT recombinante. As enzimas adquiridas foram produzidas e os resultados foram aceitáveis e apresentou atividade apesar de ser necessário realizar melhorias na purificação dessas enzimas. |
| Palavras-chave | Polimerase, transcriptase reversa, biologia molecular |
| Forma de apresentação..... | Painel |
| Link para apresentação | Painel |
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