"Ciências Básicas para o Desenvolvimento Sustentável"
24 a 26 de outubro de 2023
Trabalho 18074
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG, Outros |
| Primeiro autor | Luana Maria Pacheco Schittino |
| Orientador | TIAGO ANTONIO DE OLIVEIRA MENDES |
| Outros membros | Gabriele Lopes Knop, Jacqueline Araújo Fiúza, Renato Lima Senra |
| Título | Desenvolvimento de uma plataforma de produção da glicoproteína fator VII de coagulação sanguínea por expressão heteróloga em Leishmania tarentolae |
| Resumo | A glicoproteína Fator VII é precursora da cascata de coagulação sanguínea e sua ausência ou deficiência pode acarretar em hemofilia, que atinge milhares de brasileiros. A produção industrial de glicoproteínas é um mercado crescente e, de modo geral, influenciada pelas limitações que os organismos utilizados no processo apresentam. O Fator VII é produzido em células de mamíferos por conta da necessidade de glicosilação. Porém, esse sistema de expressão apresenta baixo rendimento e alto custo de produção. Por ser uma proteína poli-glicosilada, algumas de suas funções podem ser comprometidas quando produzida em organismos, como bactérias e leveduras, que não realizam glicosilação ou realizam de forma incompleta. O objetivo geral desse projeto é utilizar uma cepa de Leishmania tarentolae, um protozoário não patogênico, geneticamente otimizado para expressão da proteína com perfil de glicosilação semelhante ao de humanos, para produção de fator VII com padrão de glicosilação de mamíferos. Para tal, a sequência do gene foi recuperada do banco de dados Uniprot e foi feita a otimização de códons para o gênero Leishmania pela plataforma IDT Códon Optimization. Além disso, foram feitas também a síntese comercial do gene em vetor de expressão pET28-a, a síntese de primers específicos, a clonagem nos vetores pLEXSY-blecherry4, transformação em E. coli SHuffle T7 e transfecção em L. tarentolae para expressão, validação e purificação da proteína. A confirmação das clonagens foi realizada a partir da extração de DNA plasmidial, PCR utilizando primers específicos para o gene e cada vetor e também por sequenciamento. A expressão e purificação em E. coli foi avaliada por SDS-PAGE e Western Blot. A integração do cassete de expressão no genoma de L. tarentolae foi confirmada por microscopia de fluorescência. A seleção clonal em L. tarentolae foi realizada por meio de plaqueamento em meio BHI seletivo. Posteriores testes de expressão proteica em Leishmania devem ser procedidos, bem como testes de atividade biológica das amostras de FVII produzidas em E. coli, L. tarentolae wild type, L. tarentolae otimizada e FVII comercial para fins de comparação de massa molecular e funcionalidade adquirida pela adição do padrão de glicosilação. |
| Palavras-chave | glicosilação, Leishmania tarentolae, glicoproteína |
| Forma de apresentação..... | Painel |
| Link para apresentação | Painel |
|---|