“Inteligência Artificial: A Nova Fronteira da Ciência Brasileira”
19 a 24 de outubro de 2020
Trabalho 13478
| ISSN | 2237-9045 |
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| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Rafaella Carvalho Breder |
| Orientador | VALERIA MONTEZE GUIMARAES |
| Outros membros | Kimberly Luciana Beira-Mar dos Santos |
| Título | Expressão de LPMO do fungo Chrysoporthe cubensis em Pichia pastoris, caracterização e aplicação na sacarificação de biomassa lignocelulósica. |
| Resumo | As monooxigenases líticas de polissacarídeos (LPMO) são enzimas com atividades auxiliares às hidrolases na sacarificação de biomassa lignocelulósica, presentes nos coquetéis comerciais usados na indústria para a produção de etanol de segunda-geração (2G). As LPMOs usam o peróxido de hidrogênio como co-substrato, necessitam de um doador de elétrons e dependem da presença do íon cobre. O uso dessas enzimas auxiliares nas misturas comerciais tem sido a chave para o alto rendimento dos processos bioquímicos de hidrólise da biomassa e produção de bioetanol. Essa pesquisa tem como objetivo a expressão em P. pastoris de uma LPMO da família AA9, presente no secretoma do fungo Chrysoporthe cubensis. Para isto, a reativação e seleção de clones de P. pastoris, previamente transformados com o gene da LPMO, ocorreu em meio YPD com 100 μg/mL de zeocina por 3-5 dias, sendo o controle negativo feito sem zeocina. Em seguida, o ensaio de expressão foi conduzido seguindo o Manual de expressão da Invitrogen®, com algumas adaptações. A quantificação proteica foi realizada espectrofotometricamente em A280 e a separação e visualização das proteínas secretadas foi feita por eletroforese SDS-PAGE 12% corado com nitrato de prata. Posteriormente, o ensaio de atividade enzimática foi realizado como descrito por Breslmayr et al. (2018). Em adição, para averiguar se a enzima de interesse, LPMO, estava localizada intracelularmente, a etapa de lise celular foi realizada. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e como controle negativo foi utilizada a célula de P. pastoris com o vetor vazio. Os resultados de quantificação proteica indicaram baixa expressão de proteínas por P. pastoris tanto intracelularmente, como baixa secreção de proteínas no sobrenadante. Embora um ensaio para atividade de LPMO em misturas proteicas não esteja bem definido na literatura, de acordo com o protocolo utilizado, não foi detectada a atividade de LPMO. Também, os resultados da visualização das proteínas em gel foram inconclusivos, uma vez que não foi possível identificar uma banda proteica mais intensa, de tamanho esperado, 35 kDa. Esses resultados, em conjunto, indicam que nos clones analisados, a LPMO de C. cubensis não foi expressa com sucesso em P. pastoris. Isso pode ter sido decorrente de fatores relacionados à clonagem, integração de forma incorreta do vetor, ou um possível efeito negativo da concentração de zeocina na manutenção dos clones. Dessa forma, para que seja possível a detecção dessa LPMO ativa e secretada na cultura de P. pastoris, novos clones deverão ser avaliados e o protocolo de atividade de LPMO deverá ser aperfeiçoado. |
| Palavras-chave | Expressão heteróloga, LPMO, sacarificação |
| Forma de apresentação..... | Painel |
| Link para apresentação | Painel |
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