“Bicentenário da Independência: 200 anos de ciência, tecnologia e inovação no Brasil e 96 anos de contribuição da UFV”.
8 a 10 de novembro de 2022
Trabalho 17173
| ISSN | 2237-9045 |
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| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Microbiologia |
| Setor | Departamento de Biologia Geral |
| Bolsa | CNPq |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CNPq |
| Primeiro autor | Camilla Garcia Regis Leite |
| Orientador | SERGIO OLIVEIRA DE PAULA |
| Outros membros | Luciana de Souza Fernandes, Paloma Cavalcante Cunha, Roberto Sousa Dias |
| Título | Expressão heteróloga do domínio de ligação ao receptor (RBD) das variantes Wild-Type, P1, B.1.1.7 E B.1.351 do SARS-CoV-2 em Komagataella phaffii |
| Resumo | A pandemia de Covid-19 se iniciou no final de 2019, na província de Wuhan, na China e até junho de 2022 resultou na morte de mais de 6 milhões de pessoas em todo o mundo. Esta doença é causada pelo vírus SARS-CoV-2 que resulta em uma síndrome respiratória aguda grave e que já infectou mais de 540 milhões de pessoas. Atualmente, já existem vacinas sendo comercializadas e a vacinação mundial está bem adiantada, entretanto, ainda é de extrema urgência o desenvolvimento de novos candidatos vacinais contra as variantes que estão surgindo, bem como a padronização de kits diagnósticos de baixo custo. Dessa forma, o trabalho teve como objetivo a expressão heteróloga em Komagataella phaffii (Pichia pastoris) do Domínio de Ligação ao Receptor (RBD) de quatro variantes do SARS-CoV-2: wild-type (WT), P1, B.1.1.7 e B.1.351. A utilização de leveduras para a expressão proteica vem sendo amplamente aplicada devido a sua facilidade de manuseio,baixo custo e capacidade de escalonamento da produção de proteínas heterólogas. Além disso, o RBD é um pequeno fragmento da proteína spike (S) do SARS-CoV-2 utilizado como uma etapa fundamental durante a infecção, uma vez que o vírus usa o RBD para interagir com o receptor da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) nas células hospedeiras. Inicialmente, foram obtidas comercialmente construções contendo a sequência otimizada para cada uma das variantes em vetor pPICZαA, sendo denominadas: RBD_WT, RBD_P1, RBD_B.1.1.7 e RBD_B.1.351. Com o intuito de amplificar a quantidade de plasmídeo, foi realizada a transformação de bactérias E. coli TOP10F por eletroporação, seguido de confirmação dos transformantes por PCR. Após, foi realizada a transformação de K. phaffii com cada uma das construções linearizadas e confirmação dos transformantes por PCR. A expressão das proteínas recombinantes foi realizada por cultivo dos transformantes em meio BMM com adição de metanol 2% por 7 dias, a 20 °C. O sobrenadante foi coletado e purificado por cromatografia de afinidade utilizando a coluna His Trap Chelating acoplada ao aparelho de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC). Em seguida, as proteínas foram concentradas em membrana de ultrafiltração. Para confirmação da expressão das proteínas, foi realizado SDS-PAGE seguido de um Western Blot utilizando o anticorpo monoclonal anti-His. As clonagens em E. coli e K. phaffii foram confirmadas, com observação de um fragmento de 1210 pb, como o esperado. Também foi confirmada a expressão das proteínas RBDs em K. phaffii na qual foi possível observar uma banda entre 55 e 70 kDa, tamanho esperado para a proteína RBD em sua forma dimérica. Portanto, o desenvolvimento desta plataforma de expressão heteróloga para a produção vacinas recombinantes no combate à Covid-19 e de kits diagnósticos é promissor e essencial para os dias atuais, haja vista a necessidade de uma resposta rápida frente às novas variantes do vírus que podem surgir no futuro. |
| Palavras-chave | SARS-CoV-2, RBD, Expressão |
| Forma de apresentação..... | Painel |
| Link para apresentação | Painel |
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