"A Transversalidade da Ciência, Tecnologia e Inovações para o Planeta"
5 a 7 de outubro de 2021
Trabalho 15330
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PIBIC/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FUNARBE, Outros |
| Primeiro autor | Livia Batista Galinari |
| Orientador | TIAGO ANTONIO DE OLIVEIRA MENDES |
| Outros membros | Thaysa Leite Tagliaferri |
| Título | Desenvolvimento in sílico de uma plataforma multiplex de CRISPR-Cas9 para reversão da resistência a carbapenêmicos em Acinetobacter baumanii. |
| Resumo | Infecções causadas por bactérias resistentes a antibióticos são um grande problema de saúde global que ocasiona centenas de milhares de mortes por ano. Em especial, os níveis de resistência antimicrobiana (RAM) da bactéria Gram-negativa Acinetobacter baumanii a carbapenêmicos, conferido principalmente pelos genes de resistência da família blaoxa, tem aumentado exponencialmente nas últimas décadas, elevando o patógeno ao maior nível de prioridade da Organização Mundial de Saúde (OMS) para pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos. Para enfrentar esse problema, métodos alternativos vêm sendo explorados, como o uso do sistema CRISPR-Cas9 para a reversão da RAM, foco desse estudo. Para tal, nosso trabalho objetivou a construção in sílico de RNAs guia (sgRNA) para um sistema de CRISPR-Cas9 multiplex com alvo para dois genes da família blaoxa, visando a total remoção do plasmídeo ou inativação dos genes de resistência e a consequente re-sensibilização de isolados clínicos. Inicialmente, os genes alvo de RAM da família blaoxa presentes em A. baumanii foram especificados quanto ao espectro de resistência e posteriormente selecionados a partir da sua prevalência no Brasil e relevância clínica. Os dois genes escolhidos, blaoxa-72 e blaoxa-143, tiveram seu sítio ativo localizado e caracterizado, para que os sgRNAs selecionados estejam posicionados anteriormente à essa região. Nesse sentido, as sequências dos genes de resistência foram alinhadas por meio do programa Clustal Omega, para identificar regiões conservadas que possuam, na porção terminal, o trinucleotídeo NGG necessário para clivagem pela enzima Cas9. Em seguida, dois sgRNAs foram selecionados, sendo um deles com 100% de complementariedade aos dois genes blaoxa de resistência escolhidos. Os potenciais sgRNAs considerados foram alinhados contra 96 genomas de A. baumanii para assegurar a presença dessas sequências nos isolados, bem como detectar regiões fora do alvo (off-targets) que poderiam ter um alinhamento significativo com os sgRNAs. A partir dessa análise, obtivemos 917 regiões de alinhamento, dentre essas, os potenciais off-targets foram caracterizados e examinados, mas não demonstram riscos para o projeto. Ademais, as sequências que apresentaram total alinhamento foram analisadas, confirmando que pertencem de fato aos genes de beta-lactamases (on-target). Com base nas análises in sílico apresentadas, os sgRNAs serão clonados em um vetor contendo o CRISPR-Cas9 e a capacidade desse sistema de reverter a resistência será testada experimentalmente utilizando isolados clínicos da bactéria. |
| Palavras-chave | CRISPR-Cas9, resistência antimicrobiana, carbapenêmicos |
| Forma de apresentação..... | Vídeo |
| Link para apresentação | Vídeo |
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