Fome e Abundância: Um Paradoxo Brasileiro?
17 a 22 de outubro de 2016
Trabalho 6721
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Biotecnologia |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | FAPEMIG |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Lethícia Kelly Ramos Andrade |
| Orientador | JULIANA LOPES RANGEL FIETTO |
| Outros membros | Filippe Gadiolli Pimentel, GUSTAVO COSTA BRESSAN, MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO, Yaro Luciolo dos Santos |
| Título | Clonagem e expressão heteróloga das NTPDases de Leishmania infantum em Leishmania tarentolae |
| Resumo | As leishmanioses são zoonozes causadas por protozoários do gênero Leishmania que infectam mamíferos. A doença pode se manifestar em duas formas clinicas: tegumentar que afeta pele e mucosas e visceral que acomete principalmente medula óssea e vísceras. Esta última é a forma mais grave da doença e tem como agente etiológico principal no Novo Mundo L. infantum. Sabe-se que durante o processo de interação parasito x hospedeiro várias protéínas do parasito interagem com o hospedeiro e possibilitam a infecção. Duas proteínas que participam desse processo são as NTPDases 1 e 2 estudadas nesta pesquisa. Estas são enzimas do tipo ecto-nucleotidases envolvidas com a infecciosidade, adesão celular e controle da resposta imune do hospedeiro. Para melhor estudar estas proteínas e suas aplicações biotecnológicas este projeto busca sua produção por sistema heterólogo eucariótico comercial pLexy baseado na expressão heteróloga em L. tarentolae. As vantagens deste sistema frente ao já testado sistema bacteriano incluem a maquinaria eucariotíca de expressão proteica e de modificações pós-traducionais. Inicialmente foi feita a sub-clonagem das regiões codidifcantes do domínio nucleotidase das NTPDases 1 e 2 de L. infantum, usando o sistema InFusion de sub-clonagem, em vetor plexsy bleacherry 4 de expressão induzível episomal (Jena Biosciences). Este sistema produz a proteína de interesse fusionada a cauda de Hexa-histidina e uma proteína repórter fluorescende (Cherry) que auxiliam na purificação da protéina de interesse e na visualização do funcionamento do sistema de expressão. As construções foram usadas para transformar E. coli DH5-alfa onde forma obtidos os clones de interesse. Então, foi feita a transfecção de L. tarentolae cepa T7 isoladamente com cada uma das construções (pLexyBleacherry4-LiNTPDase1 e pLexyBleacherry4-LiNTPDase2). Após transfectadas as células foram colocadas para crescer em meio líquido e depois de 24h foram transferidas para placas para seleção de clones. Um total de 7 colônias foram selecionadas, sendo cinco referentes à NTPDase1 e duas referentes à NTPDase2. Estas colônias foram expandidas e induzidas com antibiótico indutor por três dias. O funcionamento do sistema de expressão foi confirmado pela expressão da proteína repórter identificada por meio de fluorescência. Já a expressão das protéinas alvo foi avaliada por dot-blotting e western blotting usando anticorpo anti-cauda de hexa-Histidina. Os resultados evidenciaram a expressão de proteína contendo a cauda de histidina porém com massa molecular menor do que o esperado sugerindo que houve alguma mutação nas construçõe após a transfecção. Esta suspeita está sendo investigada e caso seja comprovada indicará que o sistema indutivo lexsy é instável para expressão das proteínas em questão. Como alternativa mudamos o plasmídio de expressão para expressão constitutiva (pLexyNeo). Atualemnte estamos na fase de seleção clonal. |
| Palavras-chave | Leishmaniose visceral, Leishmania infantum, clonagem |
| Forma de apresentação..... | Painel |