Fome e Abundância: Um Paradoxo Brasileiro?
17 a 22 de outubro de 2016
Trabalho 6045
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Biotecnologia |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | Outros |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | Outros |
| Primeiro autor | Helaindo Guimarães Júnior |
| Orientador | JULIANA LOPES RANGEL FIETTO |
| Outros membros | ABELARDO SILVA JUNIOR, GUSTAVO COSTA BRESSAN, MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO, Nancy da Rocha Torres |
| Título | Clonagem do gene da NTPDase 2 das cepas ET e NSL de Leishmania braziliensis |
| Resumo | A Leishmaniose é uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, apresentando-se prevalentemente nas formas tegumentares e visceral. Segundo dados do Global Health Observatory, estima-se que mais de 98 países são endêmicos para a doença e que ocorrem, a cada ano, aproximadamente, 0,4 milhões e 1,2 milhões de novos casos de Leishmaniose visceral e tegumentar, respectivamente. A doença exibe aspectos clínicos diferentes de acordo com a espécie envolvida e virulência do parasito. Atualmente, o controle da doença envolve medidas como o emprego de drogas com alta taxa de toxicidade e a eutanásia de cães domésticos infectados, uma vez que os cães atuam como reservatórios e são altamente susceptíveis à infecção. Estudos já realizados mostram que as E-NTPDases de diferentes espécies de Leishmania, participam da adesão às células alvo e da modulação do sistema imune do hospedeiro. Foi mostrado também que diferentes cepas de Leishmania braziliensis apresentam atividade ectonucleotidásica diferenciada que afeta o desenvolvimento da forma clínica. Desse modo, acredita-se que uma maior de hidrólise de nucleotídeos extracelulares esteja relacionada com uma maior virulência dos parasitos, e que a enzima NTPDase 2 possa estar envolvida nesse processo. Assim, o objetivo desse trabalho consiste na clonagem, sequenciamento e expressão heteróloga da proteína NTPDase 2 de duas cepas de L. braziliensis, ET e NSL, a fim de avaliar a presença de polimorfismos de base única que possam justificar a diferença de atividade ectonucleotidásica já observada. Além disso, a obtenção da proteína recombinante permitirá avaliar seu potencial para imunodiangnóstico de leishmaniose tegumentar. O gene da NTPDase 2 das cepas ET e NSL de L. braziliensis foi amplificado por PCR, utilizando primers gene específicos, contendo a adição das sequências de restrição das enzimas NdeI e HindIII. Os produtos gerados foram purificados a partir de gel de agarose 1%, seguido de ligação blunt-end no vetor de clonagem pJET 1.2/blunt. A reação de ligação foi usada para transformar células de Escherichia coli DH5-Alpha competentes. Vários clones obtidos foram sequenciados. Dos clones obtidos, foram escolhidos um referente a cada cepa para a realização da clonagem no vetor de expressão pET21b. Os plasmídeos contendo inserto, e o vetor pET21b foram submetidos a reações de digestão com as mesmas enzimas. A confirmação da clonagem foi feita por PCR, digestão e sequenciamento. As construções foram analisadas no programa Geneious 6.0.6 e confirmam a clonagem em frame no vetor e a presença com a cauda de hexa-histidina carboxi-terminal. Não foi observada diferença na sequência de aminoácidos referente às enzimas, porém ambas apresentaram dois SNP’s silenciosos nas posições 861 e 879. Portanto a expressão será inicialmente realizada apenas para a enzima de uma cepa em paralelo com novas análises de polimorfismos para um maior número de clones ainda não sequenciados completamente. |
| Palavras-chave | Leishmania braziliensis, clonagem, NTPDase2 |
| Forma de apresentação..... | Painel |