Fome e Abundância: Um Paradoxo Brasileiro?
17 a 22 de outubro de 2016
Trabalho 5870
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Farmacologia e bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PIBIC/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Leilane Ferreira Teixeira |
| Orientador | GUSTAVO COSTA BRESSAN |
| Outros membros | Éverton de Almeida Alves Barbosa, Marcus Vinícius de Andrade Barros, ROBSON RICARDO TEIXEIRA, Thiago Souza Onofre |
| Título | Identificação de potenciais inibidores da Serine Arginine Protein Kinase 1 de Plasmodium falciparum (PfSRPK1) |
| Resumo | A malária é uma doença negligenciada causada por parasitos do gênero Plasmodium, sendo a espécie P. falciparum responsável pela forma mais letal da doença. A cinase reguladora de splicing PfSRPK1 foi identificada como um fator fundamental à progressão dos ciclos de desenvolvimento do parasito, tanto na fase assexuada como sexuada. Sua ausência bloqueia completamente a formação de gametas masculinos sexualmente competentes e reduz a parasitemia, o que aponta a PfSRPK1 como um alvo promissor para o desenvolvimento racional de antimaláricos. Desta forma, este trabalho teve por objetivos clonar, expressar, purificar e realizar ensaios de deslocamento térmico (Thermal Shift) visando selecionar possíveis inibidores para PfSRPK1. A sequência gênica responsável por codificar a PfSRPK1 foi clonada no vetor pET-28a, utilizando as enzimas de restrição SalI e HindIII. O plasmídeo recombinante foi transformado em E. coli BL21 (DE3) RIL e foram testadas diferentes concentrações do indutor Isopropil-β-D-Galactosídeo (IPTG) e diferentes tempos de indução, sendo a expressão da proteína avaliada por SDS-PAGE 15% e Western-blot. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade ao níquel e por cromatografia de exclusão molecular, com ambas as colunas acopladas ao sistema FPLC. A proteína purificada foi submetida a ensaio de Thermal Shift no termociclador 7500 Real-Time PCR System®, e a temperatura de melting (Tm) dos complexos PfSRPK1-ligante foi estimada pelo monitoramento do desenovelamento da proteína utilizando-se o corante SYPRO Orange®. Foi utilizado um conjunto de 24 substâncias desenhadas e sintetizadas para atuarem como inibidores de SRPKs. Os resultados do teste de indução mostraram que as quantidades de proteína induzidas foram equivalentes em ambas as concentrações de IPTG testadas, havendo uma expressão basal no tempo de 0h. Após 1h de indução a proteína se encontra em maior concentração na fração solúvel e, com o passar do tempo, a expressão passa a ser maior na fração insolúvel. A cromatografia de afinidade removeu parte dos contaminantes da proteína de interesse, sendo o restante removido por cromatografia de exclusão molecular. Os ensaios de Thermal Shift permitiram identificar pelo menos um composto capaz de aumentar o Tm da PfSRPK1.Este aumento pode estar relacionado a uma maior estabilidade do complexo PfSRPK1-ligante, o que o coloca em posição de destaque como potencial inibidor da cinase. Diante dos resultados obtidos conclui-se que a abordagem experimental utilizada foi capaz de fornecer a PfSRPK1 em concentração e pureza suficientes para realização dos ensaios de Thermal Shift, com o qual foi possível selecionar pelo menos um ligante, o qual precisa ser melhor avaliado como potencial inibidor em estudos subsequentes. |
| Palavras-chave | Inibidor, PfSRPK1, Thermal Shift |
| Forma de apresentação..... | Painel |