Fome e Abundância: Um Paradoxo Brasileiro?
17 a 22 de outubro de 2016
Trabalho 5831
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Biotecnologia |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PIBIC/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Ana Maria dos Santos Camargos |
| Orientador | VALERIA MONTEZE GUIMARAES |
| Outros membros | Guilherme Fraga Loureiro, Rafaela Zandonade Ventorim |
| Título | Mutagênese Sítio-Dirigida da Xilanase XynA de Orpinomyces e Purificação e Caracterização das Xilanases Mutantes Obtidas |
| Resumo | As xilanases são glicosil hidrolases que catalisam a hidrólise aleatória de ligações glicosídicas β-1,4 internas da xilana com a formação de xilo-oligossacarídios solúveis. Essas enzimas têm sido utilizadas em várias aplicações biotecnológicas, no entanto, suas propriedades bioquímicas nem sempre são adequadas às condições dos processos industriais. Nesse trabalho, a técnica de mutagênese sítio-dirigida foi empregada com o propósito de obter xilanases mutantes, derivadas do gene xynA de Orpinomyces, mais estáveis. As xilanases SWT e SM2 (V108A; A199T) foram utilizadas como molde para a deleção de resíduos de aminoácidos específicos (G10, T30, N53, Q109 e G110) em regiões flexíveis da molécula, identificados por modelagem por homologia e dinâmica molecular. Oito enzimas mutantes foram obtidas: SWT-G10, SWT-T30, SWT-N53, SWT-Q109/G110, SM2-G10, SM2-T30, SM2-N53 e SM2-Q109/G110. Após confirmação das deleções, E. coli BL21(DE3)RIPL foi transformada para superexpressão das enzimas. A concentração de IPTG de 0,25 mM promoveu a melhor produção das xilanases ativas e solúveis. A xilanase SWT e as mutantes SWT-G10, SWT-T30, SWT-N53 e SWT-Q109/G110, avaliadas quanto ao efeito das deleções na estabilidade térmica, exibiram valores de meia-vida a 50 °C de 2,3; 0,3; 10,9; 0,8 e 6,7 h, respectivamente; enquanto SM2 e as mutantes SM2-G10, SM2-T30, SM2-N53 e SM2-Q109/G110 tiveram valores de 29,5; 0,7; 20,8; 3,3 e 0,7 h , respectivamente. Após purificação por cromatografia de troca iônica, o grau de pureza avaliado por SDS-PAGE revelou apenas uma banda proteica relativa às xilanases. As enzimas purificadas apresentaram maior atividade de 40-60 °C e pH 5-8. Os valores de kM das xilanases variaram de 0,6-2,5 mg.mL-1. Além disso, os valores de kcat/kM evidenciaram que a deleção de T30 em SWT aumentou a eficiência catalítica da enzima, enquanto a mesma deleção em SM2 não promoveu alteração. Análises de especificidade por substratos demonstraram que as xilanases exibem atividades variadas em xilanas com diferentes composições e arranjos estruturais. A maioria das xilanases foi menos ativa sobre xilana oat spelt, que tem a cadeia principal de resíduos de xilose altamente ramificada com resíduos de arabinose, indicando o menor acesso das enzimas aos seus sítios de hidrólise. Por outro lado, as maiores atividades de xilanase foram observadas sobre xilana birchwood, que apresenta menor complexidade estrutural. Além disso, as xilanases em estudo não foram capazes de hidrolisar substratos aril sintéticos contendo xilose ou celulose, indicando que estas enzimas são endo-1,4-β-xilanases pertencentes à família GH11 e consideradas “xilanases verdadeiras”. Dessa forma, a mutagênese sítio-dirigida foi eficiente para promover a deleção dos resíduos de aminoácidos específicos e aumentar a estabilidade térmica das novas xilanases mutantes. SWT T30 e SM2 T30 destacaram-se quanto à termoestabilidade, indicando que estas enzimas são mais adequadas aos processos industriais. |
| Palavras-chave | mutagênese, xilanase, termoestabilidade |
| Forma de apresentação..... | Oral, Painel |