Ciência, saúde e esporte: conhecimento e acessibilidade
21 a 26 de outubro de 2013
Trabalho 775
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Biologia e manejo de doenças e pragas de plantas |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PIBIC/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Rafael de Almeida Barros |
| Orientador | MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA |
| Outros membros | JOEL ANTONIO DE OLIVEIRA, Laura Gonçalves Costa Martins, Thainara Aparecida Mendes, Verônica Aparecida Faustino |
| Título | Caracterização enzimática de cisteíno-proteases parcialmente purificadas do intestino médio de Anticarsia gemmatalis |
| Resumo | A cultura da soja está sujeita ao ataque de diferentes espécies de insetos. O uso de bioinseticidas afeta o desenvolvimento de insetos, controlando seu número na lavoura sem afetar o meio ambiente e o homem. Os inibidores de proteases destacam-se como uma ferramenta para minimizar o ataque de pragas à cultura. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar bioquímico e cineticamente cisteíno-proteases produzidas no trato intestinal da lagarta Anticarsia gemmatalis. O extrato enzimático foi obtido por rompimento celular de cinco intestinos de A. gemmatalis no 5º instar. Cisteíno-proteases do intestino médio de Anticarsia gemmatalis foram parcialmente purificadas utilizando-se precipitação diferencial com 30 – 60% de (NH4)2SO4 e cromatografia de afinidade com coluna de aprotinina-agarose. As proteínas não ligadas à coluna, ou seja, todas as proteínas presentes no extrato bruto com exceção das serino-proteases ligadas à aprotinina-agarose, que apresentaram atividade proteolítica, foram reunidas num pool enzimático e caracterizadas utilizando o substrato sintético L-BApNA na presença do inibidor de serino-proteases benzamidina. Uma nova etapa de purificação foi testada utilizando-se uma coluna de thiol-sepharose, específica para cisteíno-proteases. Porém após essa etapa as frações proteicas obtidas não apresentavam atividade enzimática. Seguiu-se com a caracterização utilizando-se o pool enzimático obtido da aprotinina-agarose. Observaram-se picos de atividade nos valores de pH 4,0, 5,5 e 8,0, sendo o pH 8,0 o de melhor atividade. Com relação à influência da temperatura, observaram-se dois picos mais discretos de atividade a 20ºC e entre 35 – 45ºC, e um pico de atividade pronunciada na faixa entre 55 – 60ºC. O KM app obtido foi de 0,74 mM e a Vmaxapp foi 0,8 µM.min-1. A análise do efeito de íons cálcio mostrou que as cisteíno-proteases parcialmente purificadas são cálcio-dependentes e apresentaram melhor atividade em 30 mM de CaCl2. Nos ensaios de inibição foram testados EDTA (inibidor de metalo-proteases), Pepstatina A (inibidor de aspartil-proteases), Aprotinina e TLCK (ambos inibidores de serino-proteases). O único resultado significativo observado foi para a concentração de EDTA. Houve diminuição de atividade frente ao aumento da concentração de EDTA, comprovando a dependência de íons Ca2+ por essas proteases. Pepstatina A, Aprotinina e TLCK não apresentaram efeito significativo sobre a atividade de cisteíno-proteases parcialmente purificadas de A. gemmatalis. A presença do inibidor de serino-proteases benzamidina e do agente redutor DTT no meio reacional, juntamente com o teste de dois inibidores de serino-proteases aprotinina e TLCK comprovam a atividade de cisteíno-proteases testadas no presente trabalho. |
| Palavras-chave | cisteíno-protease, Anticarsia gemmatalis, interação planta-inseto |
| Forma de apresentação..... | Oral |