Resumo |
Enzimas são biocatalizadores que conferem vantagens com relação à aplicação industrial comparadas a agentes químicos. Porém, muitas não são adequadas às condições dos processos industriais realizados em condições extremas de pH e temperatura. Xilanases (EC 3.2.1.8) são utilizadas principalmente na indústria de papel e celulose e na bioconversão de materiais lignocelulósicos em produtos fermentáveis. Estas enzimas catalisam a hidrólise de ligações β-1,4 internas da xilana, principal componente hemicelulósico da parede celular vegetal. Esse trabalho teve como objetivo produzir xilanases GH11 mutantes derivadas de Orpinomyces PC-2, melhoradas para maior estabilidade térmica e de pH, pela técnica de evolução dirigida, purificar e caracterizar essas enzimas. Foram amplificados por PCR fragmentos de 765 pb correspondentes ao domínio catalítico das xilanases mutantes (SMX1, SMX2 e SMX3) e não mutada (WT) usando primers específicos para deleção de 81 pb e clonados em E.coli BL21(DE3)RIPL, usando o vetor pET24b. As enzimas foram super-expressas usando IPTG como indutor. Depois de rompidas as células, as xilanases foram purificadas em FPLC com coluna Q Sepharose em tampão borato de sódio 25 mM pH 8,5. Os valores de atividade específica foram 16.747,76; 858,22; 14.457,45 e 10.865,12 U/mg para WT, SMX1, SMX2 e SMX3, respectivamente, indicando alta eficiência do processo de purificação. Foi observada apenas uma banda protéica de 25 kDa em SDS-PAGE. As xilanases apresentaram maior atividade a 60 ºC e em pH 6,5, mantendo atividade de no mínimo 40% em valores de pH extremos. As enzimas apresentaram-se estáveis quando pré-incubadas em pH 2,5-11,0, recuperando a atividade após retorno ao pH ótimo. A meia vida a 60 ºC para SMX1, SMX2, SMX3 foram 42,5 h, 5,47 h, 0,56 h, respectivamente, bem superiores ao WT, 0,29 h. Os valores de KM da WT, MX1, MX2 e MX3 foram 0,094; 0,0016; 0,09 e 0,12 % p/v respectivamente, usando xilana birchwood. Houve inibição dos mutantes por HgCl2 e SDS nas concentrações de 1 mM e 2 mM. As enzimas foram posteriormente submetidas a cromatografia de exclusão molecular (S300) para realização de testes de dispersão dinâmica da luz (DLS), o que revelou a presença de agregados protéicos, embora a proteína esteja monodispersa. Estão sendo testadas as condições para aplicação industrial das enzimas no branqueamento de polpa Kraft. Conclui-se que a retirada de 27 resíduos do N terminal e super-expressão das xilanases em E. coli foi eficiente para obtenção de altas concentrações das enzimas solúveis, ativas e mais estáveis em valores de pH extremos e a 60 ºC . |