Ciência, saúde e esporte: conhecimento e acessibilidade

21 a 26 de outubro de 2013

Trabalho 210

ISSN 2237-9045
Instituição Universidade Federal de Viçosa
Nível Graduação
Modalidade Pesquisa
Área de conhecimento Ciências Biológicas e da Saúde
Área temática Biotecnologia
Setor Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Bolsa FAPEMIG
Conclusão de bolsa Sim
Apoio financeiro CAPES, CNPq, FAPEMIG
Primeiro autor Camila Gachet
Orientador VALERIA MONTEZE GUIMARAES
Outros membros Larissa Mattos Trevizano, Rafaela Zandonade Ventorim
Título Produção, purificação e caracterização de xilanases mutantes termoestáveis derivadas do gene xyn A de Orpinomyces PC-2 e aplicação na indústria de papel
Resumo Enzimas são biocatalizadores que conferem vantagens com relação à aplicação industrial comparadas a agentes químicos. Porém, muitas não são adequadas às condições dos processos industriais realizados em condições extremas de pH e temperatura. Xilanases (EC 3.2.1.8) são utilizadas principalmente na indústria de papel e celulose e na bioconversão de materiais lignocelulósicos em produtos fermentáveis. Estas enzimas catalisam a hidrólise de ligações β-1,4 internas da xilana, principal componente hemicelulósico da parede celular vegetal. Esse trabalho teve como objetivo produzir xilanases GH11 mutantes derivadas de Orpinomyces PC-2, melhoradas para maior estabilidade térmica e de pH, pela técnica de evolução dirigida, purificar e caracterizar essas enzimas. Foram amplificados por PCR fragmentos de 765 pb correspondentes ao domínio catalítico das xilanases mutantes (SMX1, SMX2 e SMX3) e não mutada (WT) usando primers específicos para deleção de 81 pb e clonados em E.coli BL21(DE3)RIPL, usando o vetor pET24b. As enzimas foram super-expressas usando IPTG como indutor. Depois de rompidas as células, as xilanases foram purificadas em FPLC com coluna Q Sepharose em tampão borato de sódio 25 mM pH 8,5. Os valores de atividade específica foram 16.747,76; 858,22; 14.457,45 e 10.865,12 U/mg para WT, SMX1, SMX2 e SMX3, respectivamente, indicando alta eficiência do processo de purificação. Foi observada apenas uma banda protéica de 25 kDa em SDS-PAGE. As xilanases apresentaram maior atividade a 60 ºC e em pH 6,5, mantendo atividade de no mínimo 40% em valores de pH extremos. As enzimas apresentaram-se estáveis quando pré-incubadas em pH 2,5-11,0, recuperando a atividade após retorno ao pH ótimo. A meia vida a 60 ºC para SMX1, SMX2, SMX3 foram 42,5 h, 5,47 h, 0,56 h, respectivamente, bem superiores ao WT, 0,29 h. Os valores de KM da WT, MX1, MX2 e MX3 foram 0,094; 0,0016; 0,09 e 0,12 % p/v respectivamente, usando xilana birchwood. Houve inibição dos mutantes por HgCl2 e SDS nas concentrações de 1 mM e 2 mM. As enzimas foram posteriormente submetidas a cromatografia de exclusão molecular (S300) para realização de testes de dispersão dinâmica da luz (DLS), o que revelou a presença de agregados protéicos, embora a proteína esteja monodispersa. Estão sendo testadas as condições para aplicação industrial das enzimas no branqueamento de polpa Kraft. Conclui-se que a retirada de 27 resíduos do N terminal e super-expressão das xilanases em E. coli foi eficiente para obtenção de altas concentrações das enzimas solúveis, ativas e mais estáveis em valores de pH extremos e a 60 ºC .
Palavras-chave xilanase, termoestabilidade, super-expressão
Forma de apresentação..... Oral
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