Das Montanhas de Minas ao Oceano: Os Caminhos da Ciência para um Futuro Sustentável
20 a 25 de outubro de 2025
Trabalho 21259
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Pós-graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Dimensões Sociais: ODS2 |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | CAPES |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Milena Godoi Lima |
| Orientador | MARIA GORETI DE ALMEIDA OLIVEIRA |
| Outros membros | HUMBERTO JOSUE DE OLIVEIRA RAMOS, Rafael Júnior de Andrade |
| Título | Expressão heteróloga na fração solúvel e purificação do peptídeo inibidor de proteases GORE 1, 2 T |
| Resumo | A Anticarsia gemmatalis, também conhecida como lagarta da soja, é uma das principais pragas de soja no Brasil; ela ataca essencialmente as folhas da planta, diminuindo sua área fotossintética e, consequentemente, prejudicando seu desenvolvimento. Uma conhecida estratégia para o controle desta praga é a inibição de enzimas do sistema digestivo da lagarta que, neste trabalho, são as proteases tripsina-like. Estudos anteriores do grupo resultaram no desenvolvimento dos peptídeos inibidores de tripsina GORE 1 e GORE 2, que apresentaram resultados promissores quanto à inibição da tripsina em testes in vitro, assim como a mortalidade dos insetos em testes in vivo. Este trabalho teve como objetivo expressar os peptídeos GORE 1 e GORE 2 in tandem na forma da quimera GORE 1, 2 T em Escherichia coli na fração solúvel e realizar sua purificação. A sequência de DNA que codifica o peptídeo foi incorporada no vetor plasmidial pET-41a(+) fusionada ao gene que codifica a glutationa-s-tranferase (GST). Células da cepa de E. coli Arctic Express transformadas com o vetor passaram pelos processos de expressão. Para o pré-inóculo, as células foram adicionadas ao meio LB seletivo (com gentamicina e kanamicina) mantidas a 37°C sob agitação de 210 rpm por 14h. O inóculo foi realizado passando o conteúdo do pré-inóculo para um volume maior de meio LB, que foi mantido a 30°C sob agitação de 210 rpm por 3h. Por fim, foi feita a indução adicionando 0,1 mM de IPTG ao meio, o conteúdo foi mantido a 13°C sob agitação de 210 rpm por 24h. Passado o período de indução, foi feita a centrifugação (4100 rpm a 4°C por 30 minutos), o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em tampão PBS. A lise celular foi feita mecanicamente utilizando um sonicador de sonda na amplitude de 80%, com intervalos de 10s on e 10s off por 5 minutos. O lisado foi novamente centrifugado e as fases coletadas para posterior análise. A purificação foi feita a partir da fração solúvel por cromatografia de afinidade usando a resina Glutatione Sepharose 4B Affinity media, a coluna usada foi a G-TrapTM 5 mL FPLC Colunm – G-Biosciences e o cromatógrafo foi o UPC900 da Amersham Sciences. A análise foi feita por sds-page. O peptídeo fusionado à GST tem massa de cerca de 25 kDa e a GST sozinha, aproximadamente 25 kDa, o resultado do gel mostrou que, mesmo a célula não transformada apresentava uma banda forte perto dos 35 kDa, por isso não foi possível identificar a proteína no gel antes da purificação. A fração purificada e concentrada, por sua vez mostrou duas bandas: uma mais forte na região dos 25 kDa e uma mais fraca próxima aos 35 kDa. Isso mostra que, apesar de a expressão ter sido realizada na fração solúvel, a maior parte da proteína está sendo clivada no processo, o que diminui o rendimento e indica a necessidade de modificações no processo. |
| Palavras-chave | Expressão heteróloga, Escherichia coli, cromatografia de afinidade |
| Forma de apresentação..... | Painel |
| Link para apresentação | Painel |
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