Das Montanhas de Minas ao Oceano: Os Caminhos da Ciência para um Futuro Sustentável
20 a 25 de outubro de 2025
Trabalho 20591
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Dimensões Sociais: ODS3 |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PIBIC/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Markson Suarez Lacôrte Lima |
| Orientador | JULIANA LOPES RANGEL FIETTO |
| Outros membros | Isadora Cunha Ribeiro, Victor Tavares Gonçalves |
| Título | Avaliação e otimização bioquímica da expressão heteróloga de uma Nucleosídeo Trifosfato Difosfohidrolase recombinante glicosilada em Leishmania tarentolae |
| Resumo | A superfamília de proteínas CD39 compreende as Nucleosídeo Trifosfato Difosfoidrolases (NTPDases), enzimas que catalisam a hidrólise de nucleotídeos trifosfato e difosfato, liberando fosfato inorgânico, tanto em espaços extracelulares quanto em compartimentos intracelulares. Ao controlar os níveis de nucleotídeos extracelulares, as NTPDases modulam a sinalização purinérgica em diversos contextos biológicos, como inflamação, resposta imune, sinaptogênese e proliferação de células tumorais. Em mamíferos, essas enzimas são glicosiladas, o que ressalta a importância da escolha de um sistema de expressão que permita modificações pós-traducionais miméticas de mamíferos para viabilizar o estudo bioquímico e estrutural dessas glicoproteínas. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão de uma NTPDase de mamífero em Leishmania tarentolae, evidenciando seu potencial para estudos de glicosilação e caracterização bioquímica de NTPDases. Para isso, foram projetadas e adquiridas comercialmente duas construções sintéticas (C#1 e C#2) de uma NTPDase recombinante (rNTPDase), com aproximadamente 59 kDa e 51kDa, respectivamente, subclonadas no vetor de expressão constitutiva pLEXSYneo2.1. O plasmídeo foi utilizado para transfectar a cepa P10 wild-type de L. tarentolae, visando obter mutantes superexpressores. As células transfectadas foram usadas para seleção de clones, resultando em 13 clones para C#1 e 14 clones para C#2. A integração do cassete de expressão no genoma foi verificada por PCR de genotipagem. A análise do perfil de expressão das proteínas secretadas no sobrenadante foi realizada por SDS-PAGE e Western Blot, usando anticorpo anti-His6x e IgG AntiMouse conjugado com AlexaFluor488. Os resultados confirmaram a produção da rNTPDase com aproximadamente 69 kDa (provavelmente glicosilada) para a C#1 e da rNTPDase com aproximadamente 59 kDa e 70 kDa (provavelmente glicosilada e hiper-glicosilada, respectivamente) para a C#2. As rNTPDases secretadas foram purificadas usando resina Ni-sepharose e as eluições foram utilizadas para ensaios de atividade enzimática com ATP, ADP e AMP, além de um ensaio de N-deglicosilação com PNGase-F para remover N-glicanos e avaliar o perfil de glicosilação de diferentes clones. A atividade enzimática apresentou uma atividade específica de 8,4 µmol Pi/mg.min⁻¹ para ATP e 3,2 µmol Pi/mg.min⁻¹ para ADP para o clone C#1D (n = 1) e uma atividade específica de 15,59±10,47 µmol Pi/mg.min⁻¹ para ATP e 18,21±12,20 µmol Pi/mg.min⁻¹ para ADP para o clone C#2A (n = 3). Como esperado o AMP não foi hidrolisado. O ensaio de N-deglicosilação mostrou uma redução no peso molecular em comparação ao controle para uma amostra purificada do clone C#1D. Os resultados confirmam o potencial do sistema LEXSY para expressão e estudos bioquímicos de NTPDases, devido à obtenção de uma enzima ativa e glicosilada. |
| Palavras-chave | NTPDases, Glicosilação, Leishmania tarentolae |
| Forma de apresentação..... | Vídeo |
| Link para apresentação | Vídeo |
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