“Bicentenário da Independência: 200 anos de ciência, tecnologia e inovação no Brasil e 96 anos de contribuição da UFV”.
8 a 10 de novembro de 2022
Trabalho 17130
| ISSN | 2237-9045 |
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| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Agrárias |
| Área temática | Medicina veterinária |
| Setor | Departamento de Veterinária |
| Bolsa | PIBIC/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Jordano Alexandre de Carvalho |
| Orientador | ABELARDO SILVA JUNIOR |
| Outros membros | Ana Alice Pimenta Pereira, Júnio César Santos, Larissa Lana de Paula Leber, Viviane Sisdelli Assao |
| Título | DIVERSIDADE GENÉTICA E AVALIAÇÃO DE EPITOPOS PUTATIVOS DE Porcine circovirus 3 |
| Resumo | Os Porcine circovirus (PCV) são uma espécie de vírus não-envelopados de DNA fita simples circular. Atualmente são conhecidas e descritas 4 espécies: PCV1, PCV2, PCV3 e PCV4. O PCV3 tem sido associado com diversas condições como falha reprodutiva, síndrome da dermatite e nefropatia suína (PDNS) e outras doenças associadas aos Porcine circovirus (PCVAD). Dessa forma, é mister a detecção desse agente em granjas suínas devido ao seu potencial prejudicial ao desenvolvimento dos animais. O objetivo desse trabalho foi realizar a padronização de um ensaio de Nested-PCR para detecção e amplificação do DNA viral para sequenciamento de amostras de PCV3 de suínos naturalmente infectados e análises de bioinformática. Foram utilizadas amostras de leitões desmamados previamente testadas por qPCR pelo grupo de pesquisa, coletadas no estado do Paraná em 2018 e 2019. Os primers foram desenhados visando amplificar a região da ORF2, que codifica o gene para a proteína do capsídeo do PCV3, a principal proteína antigênica do vírus. Para obtenção do melhor par possível, para a primeira reação foram desenhados 2 primers senso (forward) e 1 primer antissenso (reverse), e para a segunda reação foram desenhados 2 primers forward e 1 primer reverse. O desenho foi feito manualmente, buscando atingir as características ideais de um primer: aproximadamente 50% de conteúdo de bases guanina e citosina, cerca de 18 a 22 nucleotídeos e temperaturas de melting próximas. Os pares foram rodados no software Primer Blast da plataforma do NCBI para garantir a especificidade ao PCV3. O amplicon da primeira reação seria de 1206 pares de base (pb) e 1202pb. O amplicon da segunda reação seria de 1018pb e 971pb. Como controle positivo para a padronização, foi realizada a extração de DNA de uma amostra sabidamente positiva, utilizando o kit Wizard SV Genomic DNA Purification System®. Foi realizado um gradiente de temperaturas em termociclador, com o seguinte ciclo: desnaturação a 94°C/5min; 35 ciclos de desnaturação a 94°C/30s, anelamento a 53-62°C/30s, extensão a 72°C/45s; e extensão a 72°C/7min. Em seguida, as amostras correram num gel de Agarose a 1% em tampão Tris-Boro-EDTA (TBE) 0,5x. A temperatura de anelamento ótima encontrada foi de 59°C. Entretanto, não houve marcação de bandas no gel ao utilizar a técnica com as amostras do Paraná, que já haviam sido submetidas a um ensaio de PCR em tempo real (qPCR). Houve incoerência entre os resultados de Nested PCR e qPCR, de forma que não foi obtida a sensibilidade maior esperada do ensaio de Nested PCR. Pode-se hipotetizar que o ensaio estudado não se mostra viável para carga viral muito baixa e não foi possível obter a amplificação. Para continuidade do trabalho, novas amostras deverão ser coletadas considerando a doença clinica severa dos animais para amplificação por Nested-PCR. A partir destas amostras será possível encontrar animais com a carga viral mais alta e amplificar por PCR convencional e obter DNA adequado para o sequenciamento. |
| Palavras-chave | Porcine circovirus 3, Nested PCR, Biologia Molecular |
| Forma de apresentação..... | Painel |
| Link para apresentação | Painel |
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