“Bicentenário da Independência: 200 anos de ciência, tecnologia e inovação no Brasil e 96 anos de contribuição da UFV”.
8 a 10 de novembro de 2022
Trabalho 17098
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | FAPEMIG |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | FAPEMIG |
| Primeiro autor | João Victor Gonçalves Maffia |
| Orientador | ELIZABETH PACHECO BATISTA FONTES |
| Outros membros | Eugenio Ribeiro de Andrade Neto, Fredy Davi Albuquerque Silva, Marco Aurelio Ferreira |
| Título | Inativação do gene NISP, por CRISPR/Cas9, para diminuição da suscetibilidade a begomovirus em Arabidopsis thaliana |
| Resumo | Como o maior gênero da família Geminirividae, Begomovirus possui espécies com um amplo espectro de infecção em monocotiledôneas e dicotiledôneas cultiváveis, resultando em danos diversos na produção agrícola. Tendo em vista a alta gama de hospedeiros, as estratégias para driblar sistemas de defesa antivirais são sofisticadas e eficientes, tornando necessário o desenvolvimento de mecanismos moleculares capazes de fornecer proteção duradoura contra o vírus. Em parâmetros de dinâmica viral, sabe-se que o vírus usufrui de algumas proteínas do hospedeiro essenciais ao seu ciclo de vida. Dois genes previamente identificados, NISP (NSP-Interacting syntaxin 6-domain-containing protein) e NIG (NSP-interacting GTP-ase), codificam proteínas imprescindíveis para o movimento intracelular do begomovírus, cujos nocautes não interferem no desenvolvimento das plantas. Sendo assim, o objetivo da investigação foi utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para obtenção do mutante duplo nig/nisp em Arabidopsis, visando obter resistência recessiva e duradoura, o que poderia fornecer proteção de amplo espectro. Essa técnica molecular baseia-se em mecanismos de defesa natural de bactérias que inviabilizam o material genético de invasores por intermédio da Cas9. Dessa forma, RNAs guias foram desenhados a fim de direcionar a nuclease à região do gene NISP onde, atuando como uma “tesoura molecular”, clivaria o DNA na região pareada e, através dos mecanismos de reparo natural das células, poderia haver deleção ou adição de bases nitrogenadas, silenciando o gene-alvo. Após a obtenção de linhagens mutantes, a inserção da construção CR-NISP no genoma de Arabidopsis nig nocaute foi confirmada por PCR em pelo menos 20 transformantes. Para a confirmação da mutação no gene alvo NISP nos transformantes T1, foram desenhados primers flanqueando a sequência alvo do RNA guia no gene NISP. O fragmento amplificado de 700 bp foi subsequentemente digerido com a enzima EcoNI. O alelo selvagem do gene NISP contém um sítio para esta enzima de restrição sobrepondo à sequência alvo do RNA guia. Após a mutação promovida pela atuação da Cas-9, este sítio é perdido. Dos vinte transformantes independentes diagnosticados, em pelo menos nove, o fragmento amplificado de NISP (700 bp) foi derivado de dois alelos: um resistente à digestão com EcoNI (alelo mutado de 700 bp) e um digerido com a enzima (alelo selvagem), gerando dois fragmentos de 300 e 400 pb. Este padrão de digestão resultou em três fragmentos, 700 bp (alelo mutante), 300 e 400 pb (alelo selvagem) permitindo o diagnóstico da mutação ocorrida no gene NISP. As plantas T1 contendo os alelos selvagem e mutante geraram as sementes T2 para a análise de segregação e, baseando-se nas leis de segregação de alelos independentes, o genótipo alvo da pesquisa seria a ausência do gene Cas9 e o gene NISP modificado em homozigose. Experimentos estão em progresso avançando gerações a fim de obter linhagens em homozigose para os dois alelos mutados. |
| Palavras-chave | Genes de suscetibilidade, Arabidopsis, Silenciamento Gênico |
| Forma de apresentação..... | Vídeo |
| Link para apresentação | Vídeo |
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