“Bicentenário da Independência: 200 anos de ciência, tecnologia e inovação no Brasil e 96 anos de contribuição da UFV”.
8 a 10 de novembro de 2022
Trabalho 16739
| ISSN | 2237-9045 |
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| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | Não se Aplica |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Primeiro autor | Vitória de Almeida Rodrigues |
| Orientador | JULIANA LOPES RANGEL FIETTO |
| Outros membros | Isadora Cunha Ribeiro |
| Título | Teste de expressão da E-NTPDase2 de Leishmania infantum em sistema eucariótico LEXSY (Leishmania Expression System) |
| Resumo | As E-NTPDases são enzimas que hidrolisam nucleotídeos tri e difosfatados extracelulares, estando presentes em muitos organismos, como os protozoários do gênero Leishmania. Na infecção, as E-NTPDases atuam no controle da concentração de nucleotídios extracelulares sinalizadores do sistema purinérgico. Por exemplo alta atividade de E-NTPDase leva a hidrólise de ATP e ADP e acúmulo de adenosina, que ativa receptores anti-inflamatórios P1 que bloqueiam mecanismos de defesa do hospedeiro. A identificação e a caracterização bioquímica dessas enzimas em Leishmania é essencial para o desenvolvimento de inibidores para novos tratamentos para as leishmanioses. Este trabalho tem por foco o estudo da E-NTPDase2 de Leishmania infantum (LiNTPDase2) através da expressão da mesma em sistema eucarioto LEXSY, baseado em Leishmania tarentolae. Planejamos um teste de expressão a partir de um clone de L. tarentolae obtido anteriormente (P10_LiNTPDase2.7), resultante de apenas um processo de transfecção. O vetor de expressão permite que a proteína seja expressa de forma secretada e com cauda de histidina. Para o teste de expressão, as células (P10_LiNTPDase2.7) foram cultivadas em 400 mL de meio meio BHI (Brain Heart Infusion) com Hemina e Penicilina-Estreptomicina, a 25°C e 140 rpm, variando o tempo de expressão em 72 h e 1 semanas. As culturas foram centrifugadas a 5000 rpm por 10 min e o sobrenadante purificado via cromatografia de afinidade a níquel. As frações obtidas na purificação, foram submetidos à SDS-PAGE e Western blot. Porém não foi possível detectar a presença da proteína alvo nestes testes. Realizou-se então a re-transfecção no clone P10_LiNTPDase2.7 a fim de aumentar o número de cópias do gene alvo. A cepa selvagem P10_WT foi transfectada com água (controle negativo) e com o vetor vazio. Essas células foram colocadas em um meio idêntico ao utilizado para a expressão, havendo adição do antibiótico de seleção no dia seguinte. Após alguns dias, não havia mais células vivas no controle negativo; as células transfectadas com o vetor vazio e com o vetor contendo o gene de interesse tiveram um crescimento normal no meio de cultura. Por fim, a expressão da LiNTPDase2 ainda precisa ser otimizada, pois não foi possível detectar a proteína via Western blot. Entretanto, continuaremos com novas rodadas de transfecções, já que as células P10_LiNTPDase2.7 se mostraram muito viáveis após a 2ª transfecção, indicando que elas ainda têm potencial para receber mais DNA. Visamos com isso obter mutantes com maior número de cópias do gene de interesse, e que, consequentemente, terão maior capacidade de expressar a LiNTPDase2, o que favorecerá trabalhos futuros relacionados à caracterização bioquímica e aplicação biotecnológica dessa proteína. |
| Palavras-chave | E-NTPDase2, Leishmania infantum, sistema LEXSY |
| Forma de apresentação..... | Painel |
| Link para apresentação | Painel |
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