Bioeconomia: Diversidade e Riqueza para o Desenvolvimento Sustentável
21 a 25 de outubro de 2019
Trabalho 12187
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Ciências Biológicas |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PET |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | Outros |
| Primeiro autor | Yan da Silva Clevelares |
| Orientador | VALERIA MONTEZE GUIMARAES |
| Outros membros | Roberta Corsino Ferreira |
| Título | Clonagem, expressão e caracterização parcial de fitase recombinante de Penicillium pinophilum SRI-3 expressa em Pichia pastoris GS115 |
| Resumo | A fitase é a enzima responsável pela catálise da hidrólise do fitato, um fator antinutricional encontrado em matéria prima de origem vegetal, comumente utilizada na formulação de rações para animais. Fitases podem ser aplicadas em vários processos como na remediação de solos e corpos d’água contaminados com fitato e na produção de etanol 2G. Devido a importância dessa enzima e a necessidade de entender as condições para seu melhor desempenho, o presente trabalho busca produzir e caracterizar uma fitase recombinante de Penicillium pinophilum SRI-3 expressa em Pichia pastoris GS115. Os códons do gene SRI 7227 de fitase foram otimizados com objetivo de obtenção de um gene com conteúdo de códons e sítios de restrição adequados para a expressão da enzima. O gene foi colocado sobre regulação do promotor AOX1 e acrescido de uma tag de histidina para posterior purificação. A marca de seleção do vetor foi a resistência ao antibiótico zeocina. A partir da levedura transformada, foram selecionados dois clones, denominados Phy22 e Phy25, os quais demonstraram maior desenvolvimento e a produção da fitase ativa. Os ensaios de expressão da enzima foram realizados de acordo com o manual EasySelect™ Pichia Expression Kit, da Invitrogen. As melhores condições de cultivo para expressão da fitase foram determinadas a partir dos ensaios de atividade enzimática, concentração de proteínas e análise em SDS-PAGE do sobrenadante da cultura em diferentes períodos de tempo. Após identificação da banda protéica relativa à fitase em SDS-PAGE, esta foi excisada e submetida à digestão enzimática para obtenção dos peptídeos trípticos que foram analisados em um sistema LC-MS/MS com objetivo de confirmar da identidade da enzima. A purificação da fitase foi realizada por FPLC em coluna HisTrap™ nas condições determinadas pelo fabricante. Para a caracterização enzimática foram determinados os efeitos da temperatura e pH na atividade, em uma faixa de 25 a 70 ºC e 2,0 a 8,0, respectivamente. O clone Phy25 demonstrou maior desempenho na produção e na atividade enzimática em relação ao clone Phy22. Em ambos os casos, foi observada a expressão de fitase funcional a partir da clonagem em P. pastoris GS115. As análises demonstraram que o melhor tempo para expressão da enzima foi após 36 horas de indução com metanol. Após o processamento, aquisição e análise de dados de espectrometria de massas foi possível confirmar a identidade da fitase SRI7227. A maior atividade de fitase foi observada na temperatura de 55°C em pH 6,0. Os resultados obtidos indicam que a clonagem e transformação de P. pastoris GS115 com o gene SRI 7227 de fitase foram bem-sucedidos e a enzima produzida foi ativa e eficiente para hidrólise do ácido fítico. Em conjunto, os dados obtidos da caracterização parcial da fitase indicam o potencial dessa enzima para futuras aplicações biotecnológicas. |
| Palavras-chave | fitase, enzima, clonagem |
| Forma de apresentação..... | Oral |