Bioeconomia: Diversidade e Riqueza para o Desenvolvimento Sustentável
21 a 25 de outubro de 2019
Trabalho 11580
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Ciências Biológicas |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PET |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq |
| Primeiro autor | Maria Cecilia Brangioni de Paula |
| Orientador | RAPHAEL DE SOUZA VASCONCELLOS |
| Outros membros | Débora Cristina Pimentel, Éverton de Almeida Alves Barbosa, Leilane Ferreira Teixeira, ROBSON RICARDO TEIXEIRA |
| Título | Otimização da purificação da Serine-arginine Protein Kinase de Leishmania braziliensis (LbSRPK) para ensaios de estabilidade térmica |
| Resumo | A Leishmaniose é uma doença negligenciada e considerada endêmica nos cinco continentes. Os sinais clínicos manifestados pelas principais espécies brasileiras, L. braziliensis, L. amazonensis e L. infantum chagasi, se agrupam em duas grandes classes: Leishmaniose Tegumentar Americana e Visceral. A Leishmaniose Tegumentar possui sintomas extremamente desconfortantes e que não possuem um tratamento frequentemente causa efeitos colaterais graves. Além disso, o parasito pode ser resistente ao tratamento e o fármaco necessita de administração ambulatorial. Por isso, a OMS tem estimulado o desenvolvimento de novos. As Serine-arginine Protein Kinases (SRPK) são cinases que atuam no processo de splicing em mamíferos e pouco se sabe sobre elas em protozoários. A primeira SRPK de tripanosomatídeo foi descrita por Portal e colaboradores para Trypanosoma cruzi em 2003, e é a única caracterizada até o momento. Trabalhos do nosso grupo sugerem que a inibição dessa enzima em L. braziliensis (LbSRPK) é capaz de levar o parasito à morte, abrindo caminhos para o desenvolvimento de novos medicamentos. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi produzir a LbSRPK com alto nível de pureza para avaliação de potenciais inibidores sobre a enzima recombinante em ensaio de estabilidade térmica. A LbSRPK foi clonada no vetor de expressão pET28a e expressa em E. coli BL21 (DE3) RIL. Após a expressão, as células foram lisadas e o sobrenadante foi submetido à cromatografia por afinidade. Foi avaliado a eluição da LbSRPK usando o tampão B, acrescido de imidazol a 300 mM, fazendo um step de 30% do tampão B e depois 100% do tampão B, e também uma purificação usando apenas 100% do tampão B. Posteriormente foi executada a quantificação proteica comparando três métodos de dosagem: Bradford, UV por espectrofotômetro NanoDrop e Bioanalyser. As frações das purificações foram analisadas em gel de SDS-PAGE 10%. A proteína obtida foi submetida à análise de estabilidade térmica (Thermal Shift) complexada com ATP, DMSO (solvente) e com compostos SRVIC 22 e SRVIC 32 (potenciais inibidores). Comparando as purificações com e sem o step de 30% do tampão B, foi observado um aumento no nível de pureza das amostras eluídas usando 30% do tampão B. O método de Bradford e o Bioanalyser apresentaram quantificações mais próximas, inferindo que a análise por NanoDrop possui maior interferência de outros compostos em solução, sendo Bradford o método escolhido para realizar as dosagens. O Thermal Shift sugere que os potenciais inibidores SRVIC 22 e 32 interagem com a LbSRPK. Esses resultados evidenciam o potencial da SRPK como alvo terapêutico. Além disso, a obtenção de uma enzima mais pura permitirá a produção de anticorpo anti-LbSRPK para o estudo da enzima no parasito. Nossos resultados sugerem que a inibição da LbSRPK poderia contribuir para o desenvolvimento de novos fármacos, auxiliando na terapia contra a leishmaniose tegumentar. |
| Palavras-chave | Leishmaniose, SRPK, Bioquímica |
| Forma de apresentação..... | Oral |