Bioeconomia: Diversidade e Riqueza para o Desenvolvimento Sustentável
21 a 25 de outubro de 2019
Trabalho 11202
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Ciências Biológicas |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | FUNARBIC/FUNARBE |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | FUNARBE |
| Primeiro autor | João Victor Badaró de Moraes |
| Orientador | JULIANA LOPES RANGEL FIETTO |
| Outros membros | GUSTAVO COSTA BRESSAN, Nancy da Rocha Torres, RAPHAEL DE SOUZA VASCONCELLOS |
| Título | Purificação e atividade enzimática da proteína NTPDase 2 das cepas ET e NSL de Leishmania (Viannia) braziliensis |
| Resumo | Leishmania braziliensis é o principal agente causador da leishmaniose tegumentar no Novo Mundo. Não há vacina para uso humano e as drogas disponíveis para tratamento causam efeitos tóxicos e resistência do parasito. Cepas de L. braziliensis apresentam atividade ectonucleotidásica diferenciada, o que afeta o desenvolvimento da doença (LEITE et. al., 2012). Ainda, tem-se sugerido que a alta hidrólise de nucleotídeos extracelulares está relacionada a maior virulência do parasito e que a NTPDase 2 está envolvida nesse processo. Resultados prévios para as cepas ET e NSL, mostraram a presença de polimorfismos não silenciosos na sequência da enzima de NSL e mutações que estão em diferentes regiões da proteína, sugerindo uma possível influência na atividade enzimática. Buscando compreender o papel dessas enzimas na virulência do parasito, o objetivo desse trabalho consiste em expressar as enzimas das cepas ET e NSL em sistema bacteriano, padronizar a purificação e avaliar a atividade de hidrólise de nucleotídeos. As construções obtidas comercialmente foram transformadas em células BL21 competentes, induzidas por 2 horas com 0,2 mM de IPTG. Em seguida, a cultura foi centrifugada a 5000 rpm por 5 minutos e o pellet foi utilizado para avaliação da proteína na fração solúvel e no corpo de inclusão. Ambas frações foram purificados por Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) utilizando coluna de níquel. Inicialmente a purificação foi feita com eluição em 100% de tampão B e o resultado analisado por SDS-PAGE e western blotting. Para melhorar a pureza foi feita purificação por afinidade em STEPS de tampão B. Para atividade enzimática, a proteína purificada foi renaturada em tampão de renaturação e a atividade foi avaliada pelo método colorimétrico para determinação de fosfato inorgânico (Pi) utilizando verde malaquita (EKMAN e JAGER, 1993), utilizando 1 µg de cada proteína para os nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Como resultado, a purificação em STEPS gerou alíquotas com poucos contaminantes que, após a renaturação, foram avaliadas quanto a atividade. Em ambos testes não foi observada atividade para AMP. Apesar do processo ter sido feito da mesma forma, as replicatas da atividade para ATP e ADP não foram reprodutíveis. Isto sugere má renaturação das proteínas. Como perspectiva, pretendemos realizar diálise para diminuição da concentração de sal, bem como testar a atividade em outros tampões contendo substâncias que auxiliam na renaturação como arginina e prolina. Além disso, pretendemos avaliar a atividade em diferentes pHs, concentração de co-fatorres e na presença de inibidores, a fim de obter a caracterização bioquímica das enzimas. |
| Palavras-chave | Leishmania, NTPDase 2, Atividade enzimática. |
| Forma de apresentação..... | Painel |