Resumo |
Proteínas com a capacidade de se ligar reversivelmente à carboidratos são chamadas de lectinas. Estas proteínas estão envolvidas em diversos processos biológicos como endocitose, tráfego intracelular de glicoproteínas, regulação da migração, adesão celular, fagocitose e no processo de invasão por patógenos. Oriunda de Brassica oleracea var. Botrytis a lectina BOL foi caracterizada bioquimicamente como uma proteína não glicosilada, termoestável até 60 oC e atividade ótima em pH 7 e 8. Ensaios preliminares demonstraram que a fagocitose e a produção de NO por macrófagos foram estimuladas na presença da lectina BOL. Com o presente trabalho objetivamos purificar a lectina BOL em larga escala para posterior realização de ensaios biológicos. Para isso floretes de couve-flor (Brassica oleracea var. Botrytis foram coletados, lavados em água corrente e processados na proporção de 1:9 (100 g de floretes em 900 mL de PBS 10mM, pH 7.4) e permaneceram sob agitação a 4 ºC, durante uma noite. Posteriormente o extrato bruto foi filtrado. O liquido obtido foi denominado EB e foi utilizado para purificação da lectina através de 3 processos cromatográficos sequenciais. O primeiro processo foi a cromatografia de afinidade através da coluna de blue-sepharose onde, 50 ml de EB foram aplicados. A fração ligante, foi eluída com 50 mM de Tris-HCl pH7,4 acrescidos de 1M de NaCl. Em seguida foi realizada a cromatografia de troca iônica, onde o material proveniente da cromatografia de afinidade devidamente dialisado foi submetido a cromatografia em coluna MonoS onde 10 ml de EB-blue foram aplicados. A fração ligante de interesse foi eluída com 50 mM de Tris-HCl pH7,4 acrescidos de 100 mM de NaCl. O material obtido foi finalmente submetido a análise de homogeneidade por SDS-PAGE 12.5% e denominado EB-MonoS. Finalmente a última cromatografia foi a de gel filtração em coluna Sephadex G-200 e sistema FPLC onde 500 μL de solução de EB-MonoS foram aplicados na coluna e frações de 0,5 mL foram coletadas sob um fluxo de 0,5 mL/min. O material final obtido passou por ensaios de hemaglutinação. Comprovada a atividade lectinica foi feita eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para verificar a pureza. O resultado da cromatografia de afinidade utilizando coluna de blue-sepharose, apresentou um pico de absorbância após a injeção de NaCl 1M e utilizando a coluna MonoS apresentou um pico após a eluição com 50 mM de Tris-HCl pH7,4 acrescidos de 100 mM de NaCl. Finalmente o gráfico representativo da cromatografia de gel filtração apresentou um pico que continha a lectina de interesse. Demais picos representam outras moléculas. Após as observações do gel constatou-se a eficácia dos processos de purificação aos quais o extrato bruto de Brassica oleracea foi submetido. |