Ciência para a Redução das Desigualdades
15 a 20 de outubro de 2018
Trabalho 9973
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Ciências Biológicas |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | FUNARBIC/FUNARBE |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | FAPEMIG |
| Primeiro autor | Yaankha Bharbara Allecxandria Bernardo da Silva Barbosa Cardoso |
| Orientador | TIAGO ANTONIO DE OLIVEIRA MENDES |
| Outros membros | Renato Lima Senra |
| Título | Otimização molecular e metabólica de Leishmania tarentolae para produção de proteínas de interesse biotecnológico |
| Resumo | Glicoproteínas e proteínas oligoméricas possuem um potencial biotecnológico expressivo na terapêutica, no entanto, os sistemas mais favoráveis para produção em escala industrial são bactérias e leveduras, organismos incapazes de promover o correto padrão de glicosilação e o dobramento adequado de proteínas de mamíferos. Como alternativa a essa incompatibilidade tem-se os sistemas baseados em insetos e em células de mamíferos, que apresentam uma baixa produtividade. Nesse contexto, Leishmania tarentolae, um protozoário tripanossomátideo não patogênico para mamíferos, tem sido apresentado como um sistema alternativo para expressão heteróloga de glicoproteínas por apresentar um padrão de glicosilação semelhante a mamíferos, ser facilmente adaptado para produção em alta escala e depender de meios de cultura de baixo custo. No entanto, ainda assim existem algumas diferenças no perfil de carboidratos de L. tarentolae localizadas nas terminações das cadeias glicídicas, devido à ausência de enzimas de biossínteses e incorporação de ácido siálico. O principal objetivo deste estudo, portanto, foi expressar o gene sialiltransferase humano em linhagens de L. tarentolae para permitir produção de proteínas glicosiladas com incorporação de ácido siálico e, assim, desenvolver uma plataforma de expressão da proteína oligoméricas interferon- utilizando linhagens de L. tarentolae selvagem e geneticamente otimizadas para síntese de glicoproteínas terapeuticas. A sequências dos genes de interesse foram projetados com os códons otimizados para serem expressos em L. tarentolae e com primers específicos desenhados adicionando os sítios de restrição estratégicos para a ligação do gene de interesse nos plasmídeos de expressão. Após isso, o gene de interesse foi amplificado a partir do gene sintético, o amplicon purificado foi ligado ao plasmídeo pGEM-T e realizou-se a transformação em células de E. coli DH5 ultracompetentes. As células de L. tarentolae P10 foram, então, transfectadas utilizando-se o vetor pLEXSY-Neo2. Por fim foi realizado ensaio de PCR, SDS-PAGE 14% e Dot Blotting para diagnosticar a recombinação dos clones. Por meio das metodologias de genômica e metabolômica apresentadas, foi possível desenvolver a primeira estratégia para sialização de glicoproteínas de L. tarentolae por meio da expressão heteróloga da enzima sialiltranferase e todos os ensaios confirmatórios apresentaram resultados satisfatórios que demonstram a eficiência do método. Os indícios apresentados pelo sucesso nas técnicas de clonagem, pela presença dos transcritos confirmada no RT-PCT, e nas técnicas de SDS-PAGE e Dotblotting demonstram que a produção do organismo geneticamente modificado foi realizada com sucesso. |
| Palavras-chave | Glicoproteínas, Leishmania, Expressão Heteróloga |
| Forma de apresentação..... | Painel |