Ciência para a Redução das Desigualdades
15 a 20 de outubro de 2018
Trabalho 9736
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Ciências Biológicas |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PET |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | Outros |
| Primeiro autor | Bianca Cristina Carvalho Reis |
| Orientador | RAPHAEL DE SOUZA VASCONCELLOS |
| Outros membros | Leilane Ferreira Teixeira, Rayane Luiza de Carvalho |
| Título | Clonagem, expressão e purificação da serine-arginine protein kinase (SRPK) de Leishmania braziliensis |
| Resumo | A leishmaniose é a terceira doença parasitária mais comum e é uma das principais doenças negligenciadas do mundo, sendo o Brasil um dos países que mais apresentam casos anualmente. Representa um grave problema de saúde mundial e apresenta diversas manifestações clínicas, podendo ser fatal. Existem diversas opções de tratamento, porém as terapias apresentam complicações como efeitos colaterais graves e/ou resistência pelo parasito. Por isso, a OMS (Organização Mundial da Saúde) tem estimulado a busca por novos alvos para fármacos que substituam ou complementem os tratamentos existes. As cinases são alvos promissores, pois participam da regulação de diversos processos celulares importantes. Dessa classe de enzimas se destaca a família das SRPKs que atuam em funções importantes como processamento do pré-mRNA em eucariotos superiores. SRPKs já foram identificadas em Trypanosoma cruzi, que pertence à mesma família da Leishmania, porém, sua função ainda não foi totalmente esclarecida. Sendo assim, o objetivo do trabalho foi buscar no genoma de L. braziliensis uma sequência de SRPk (LbSRPK) homóloga à do T. cruzi. , cloná-la e expressá-la a em sistema bacteriano. Primeiramente, a sequência predita como LbSRPK fora submetida a análises de bioinformática. Foi encontrada conservação em duas regiões de domínio cinase separadas por uma região espaçadora variável, característico das SRPKs. A sequência foi amplificada por PCR e inserida em vetor de clonagem pGEM T Easy e subclonada no vetor de expressão pET 28a. A expressão foi realizada em Escherichia coli BL21 (DE3)-RIL e analisada por eletroforese e Western-blot. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade ao níquel em sistema ÄKTA™ Purifier. Os resultados mostraram que a quantidade de proteína expressa foi semelhante nas diferentes concentrações (0,10 ou 0,25mM) de indutor Isopropil-β-D-Galactosídeo (IPTG) e temperaturas testadas (30º e 37ºC). Entretanto, a 30°C a proteína foi encontrada predominantemente na fração solúvel e a 37°C na fração insolúvel. Foram escolhidos como melhores parâmetros para expressão da proteína a temperatura de 30°C, utilizando 0,10mM de IPTG por 2h. A fração solúvel do lisado foi submetida à cromatografia por afinidade ao níquel e eluída com 300mM de imidazol. As análises por eletroforese em gel de poliacrilamida e Western Blott permitem observar que a LbSRPK é a proteína predominante na eluição. Porém, é possível observar alguns contaminantes na amostra. Para a obtenção de uma amostra mais pura outras técnicas, como a cromatografia por exclusão molecular, serão testadas após a cromatografia de afinidade. A padronização da expressão e purificação da LbSRPK permitirá a realização de ensaios de caracterização bioquímica da enzima, que confirmarão se a LbSRPK é uma SRPK genuína. Além disso, inibidores da enzima poderão ser testados, permitindo no futuro, a busca por fármacos alternativos para o tratamento das leishmanioses. |
| Palavras-chave | leishmaniose, SRPK, expressão |
| Forma de apresentação..... | Painel |