Ciência para a Redução das Desigualdades
15 a 20 de outubro de 2018
Trabalho 10411
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Pós-graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Ciências Biológicas |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | CAPES |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CAPES |
| Primeiro autor | Nancy da Rocha Torres |
| Orientador | JULIANA LOPES RANGEL FIETTO |
| Outros membros | GUSTAVO COSTA BRESSAN, João Victor Badaró de Moraes, RAPHAEL DE SOUZA VASCONCELLOS |
| Título | Clonagem, expressão e purificação da proteína NTPDase 2 das cepas ET e NSL de Leishmania (Viannia) braziliensis. |
| Resumo | Leishmania braziliensis é o principal agente causador da leishmaniose tegumentar no Novo Mundo. Não há vacina para uso humano e as drogas disponíveis para tratamento causam efeitos tóxicos e resistência do parasito. Cepas de L. braziliensis apresentam atividade ectonucleotidásica diferenciada, o que afeta o desenvolvimento da doença (LEITE et. al., 2012). Tem-se sugerido que a alta hidrólise de nucleotídeos extracelulares está relacionada a maior virulência do parasito e que a NTPDase 2 está envolvida nesse processo. Resultados anteriores para as cepas ET (de menor virulência e atividade ecto-NTPDásica) e NSL (de maior virulência e atividade ecto-NTPDásica), mostraram a presença de polimorfismos não silenciosos na sequência da enzima de NSL e mutações que estão em diferentes regiões da proteína, sugerindo uma possível influência na atividade enzimática. Foi expressa e purificada a proteína não mutante de ET, para qual foi observada baixa expressão e rendimento na purificação. Assim, objetivo desse trabalho consistiu na clonagem, expressão e purificação da enzima de NSL para avaliar se elas diferem bioquimicamente e também na análise de novos clones ET para avaliar se eles exibem uma maior expressão. A sequência correspondente ao ectodomínio da enzima de NSL foi subclonada no vetor de expressão pET21b e a construção foi transformada em células de E. coli pRARE competentes. A expressão da proteína foi feita em meio LB, usando IPTG. As amostras foram processadas e analisadas por SDS-PAGE e Western Blotting utilizando soro policlonal anti-rLicNTPDase2. A purificação foi feita por Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) e as frações foram analisadas por SDS-PAGE. Todos os clones ET analisados apresentaram baixa expressão da proteína nas condições testadas. Diferentemente o clone NSL mutante exibiu grande expressão da proteína com aumento na produção com o tempo. O mesmo foi observado após a purificação, com a proteína de ET apresentando baixa recuperação e a proteína mutante de NSL com maior quantidade de proteína purificada. Além disso, observamos que a proteína mutante está presente também na fração solúvel, o que permite seu uso na análise de atividade enzimática e cristalizção para estudos estruturais. Isso não foi observado anteriormente para a proteína de ET, sabidamente localizada em corpos de inclusão. Esses resultados nos levam a questionar se esses SNP’s podem influenciar a estabilidade dos transcritos ou a tradução proteica e se a diferença de expressão em sistema bacteriano reflete o que ocorre naturalmente nas cepas de Leishmania estudadas. |
| Palavras-chave | NTPDase2, Leishmania braziliensis, polimorfismos |
| Forma de apresentação..... | Painel |