Ciência para a Redução das Desigualdades
15 a 20 de outubro de 2018
Trabalho 10252
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Pós-graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Agrárias |
| Área temática | Ciências Agrárias |
| Setor | Departamento de Fitopatologia |
| Bolsa | Outros |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | Outros |
| Primeiro autor | Valéria Cristina Holtman |
| Orientador | SERGIO HERMINIO BROMMONSCHENKEL |
| Outros membros | Daniel Debona, Larissa Goulart Zanardo, Vanessa Rodrigues de Amorim Knupp |
| Título | Construção de um vetor binário para a transformação do fungo Phakopsora pachyrhizi via Agrobacterium tumefaciens |
| Resumo | Phakopsora pachyrhizi (filo Basidiomycota, classe Pucciniomycetes, ordem Pucciniales e família Phakopsoraceae) é o agente causal da Ferrugem Asiática da Soja (FAS). A grande capacidade de disseminação e a disponibilidade de hospedeiros do patógeno fazem da FAS a principal doença da cultura no Brasil. Diferentes técnicas para a transformação de fungos vêm sendo descritas, as quais incluem a eletroporação de protoplastos, bombardeamento por biobalística e co-cultivo com A. tumefaciens. Cada uma das técnicas possui limitações próprias, que são acompanhadas também pela dificuldade de expressão gênica heteróloga em fungo. Isso porque muitas vezes são utilizados promotores incompatíveis com o fungo a ser transformado ou genes repórteres não interrompidos por íntrons. Dada a importância da FAS para a cadeia produtiva da soja e as dificuldades de transformação de fungos, especialmente os fungos causadores de ferrugens, foi efetuada a construção de um vetor binário contendo sequencias promotoras de P. pachyrhizi e dois genes repórteres para transformação do fungo via co-cultivo com A. tumefaciens. Inicialmente foi realizada a síntese química, pela Epoch Life Science Inc, do vetor pRUST030000R, apresentando resistência a Canamicina, duas origens de replicação e um sítio múltiplo de clonagem; e a construção CS3015412R, a qual contém dois genes repórteres: o fosfinotricina acetiltransferase (BAR), cuja expressão é regulada pelo promotor do gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e o gene da subunidade C da succinato desidrogenase (SDHC*), com íntrons, regulado por seu próprio promotor e com uma substituição não-sinônima, que converte I86F. Essa mutação no gene SDHC é capaz de conferir resistência as carboxamidas. A construção CS3015412R foi então inserida no vetor pRUST030000R e transformada em células de E. coli DH5α via eletroporação. O DNA plasmidial foi extraído e utilizado para a transformação de A. tumefaciens GV3101. Uma colônia transformada foi selecionada e crescida por 16 h em meio LB líquido à 28°C. A cultura foi centrifugada e as células ressuspendidas em meio de indução, contendo 200uM de acetoseringona, e crescidas à 28°C até OD600=0,6. A cultura induzida foi misturada à solução de esporos do isolado MT10.3 de P. pachyrhizi (sensível à carboxamida) na concentração de 2x105 esporos/mL. A mistura foi inoculada por aspersão em folhas de soja cv. conquista e mantidas em co-cultivo por 24h. Decorrido esse período as folhas foram mergulhadas em solução do fungicida Elatus (Syngenta) e mantidas com 12h/12h de luz/escuro por 14 dias até a esporulação. Foram obtidas urédias esporulantes que foram inoculadas serialmente por até 5 gerações em soja. Acreditamos que o sucesso da técnica de transformação do fungo P. pachyrhizi, facilitará a manipulação deste patógeno e um melhor entendimento do processo infeccioso na soja. |
| Palavras-chave | Phakopsora pachyrhizi, transformação, vetor binário. |
| Forma de apresentação..... | Painel |