Ciência para a Redução das Desigualdades
15 a 20 de outubro de 2018
Trabalho 10154
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Ciências Biológicas |
| Setor | Departamento de Biologia Geral |
| Bolsa | CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CNPq |
| Primeiro autor | Maria Clara Nunes |
| Orientador | LEANDRO LICURSI DE OLIVEIRA |
| Outros membros | Éderson Sales Moreira Pinto, Emília Torres Costa Marques, SILVIA ALMEIDA CARDOSO |
| Título | Título: Padronização de crescimento de Escherichia coli DH5-α para expressão de TGM-2 recombinante humana |
| Resumo | A doença celíaca é uma enfermidade intestinal crônica de origem autoimune induzida pela ingestão de glúten, uma proteína presente em cereais como trigo e centeio. Ela é caracterizada pela lesão do epitélio intestinal induzida por citocinas inflamatórias, anticorpos e mecanismos de citotoxicidade celular, e afeta indivíduos geneticamente susceptíveis que, no contato da mucosa intestinal com resíduos da digestão dessas proteínas, desenvolvem resposta contra as mesmas e contra algumas moléculas do próprio organismo. Pacientes celíacos produzem anticorpos contra a enzima tecidual transglutaminase-2 (TGM-2), que podem ser detectados através de testes sorológicos. A expressão heteróloga da TGM-2 por cepas de Escherichia coli possibilitará o desenvolvimento de ensaios e testes de detecção utilizados em estudos que visam desenvolver formas práticas e acessíveis para realização do diagnóstico da doença celiaca. Porções imunogênicas da TGM-2 foram selecionadas usando ferramenta do Protein Data Bank (PDB), inseridas em plasmídeo com genes que codificam resistência a ampicilina e utilizadas na transformação de bactérias competentes da cepa E. coli DH5-α. Os clones foram selecionados e cultivados em meio LB ágar a 37°C. Colônias isoladas da placa foram inoculadas em 100 mL de caldo LB contendo 100 µL de ampicilina para evitar possíveis contaminantes e permaneceram em incubação a 37°C, a 200 RPM por 24 horas. Desses, 5 mL foram transferidos para um tubo Falcon e o crescimento foi avaliado por 3 horas. A densidade óptica (D.O.) do meio foi avaliada em intervalos de 30 minutos em espectrofotômetro, na faixa de comprimento de onda de 600 nm, a fim de se obter uma curva padrão de crescimento e determinar, assim, a cinética de crescimento bacteriano, que é o intervalo de tempo decorrido desde a inoculação até atingir a D.O. ideal para indução da expressão proteica (D.O. = 0,6). Após adição de IPTG ao meio para indução da expressão da proteína recombinante, a biomassa produzida foi submetida a sonicação e centrifugação a 7000 RPM. O sobrenadante foi descartado e foi realizada eletroforese em gel de poliacrilamida para evidenciar a presença de TGM-2, na banda correspondente a massa molecular de 77 KDa. Não fomos capazes de detectar a banda correspondente a proteína recombinante. Variações do protocolo de indução foram desenhadas e estão em teste, a fim de definir o melhor padrão de crescimento a possibilitar a expressão do antígeno recombinante. Uma possível explicação é a formação de corpos de inclusão que resultam em uma proteína insolúvel que não é dectavel na fração solúvel celular. A obtenção de antígenos capazes de interagir com anticorpos anti-TGM-2 é importante para a produção de testes imunocromatográficos que confirmem o diagnóstico de doença celíaca de forma eficaz e fácil, tornando o diagnóstico mais acessível à população e disponível em todos os centros de saúde. |
| Palavras-chave | Doença celiaca, transglutaminase-2, proteína recombinante |
| Forma de apresentação..... | Painel |