Do Lógico ao Abstrato: A Ciência no Cotidiano
23 a 28 de outubro de 2017
Trabalho 8797
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Juber Pernes Dias |
| Orientador | JOSE HUMBERTO DE QUEIROZ |
| Outros membros | Álvaro Soares Roberti, Bruna Leite Sufiate, Filippe Elias de Freitas Soares, Samara Silveira Moreira |
| Título | Proteases do látex de Euphorbia milii: purificação parcial e caracterização |
| Resumo | Euphorbia milii, conhecida popularmente como Coroa de Cristo, é uma planta rica em látex, um líquido branco leitoso encontrado no vacúolo de células secretórias específicas, chamadas laticíferas. O látex é composto principalmente por lipídios, borrachas, resinas, açúcares e proteínas, incluindo enzimas. O objetivo deste trabalho foi purificar parcialmente e caracterizar as proteases presentes no látex de E. milii. O látex de E. milii foi coletado por meio de incisões superficiais no caule e armazenado em frasco plástico a 4 °C. A atividade de proteases foi medida pelo método caseinolítico. Para o cálculo da atividade, foi construída uma curva padrão relacionando a absorbância obtida e a concentração de tirosina. Uma unidade de protease foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 µg de tirosina por minuto nas condições do ensaio. A primeira etapa de extração, concentração e separação das proteases presentes no látex consistiu em centrifugação a 10000 g e 4 °C durante 30 minutos, e a atividade enzimática foi medida em ambas as fases formadas. A segunda etapa consistiu em uma precipitação com sulfato de amônio, que foi lentamente adicionado de 10 até 90% de saturação. A atividade proteolítica do precipitado foi analisada em diferentes temperaturas (30 a 80 °C), diferentes pHs (4,0 a 9,0) e na presença de inibidores de proteases (PMSF, EDTA e β-mercaptoetanol). Foi feito um zimograma com gel de poliacrilamida 12% sem SDS contendo caseína 0,1% copolimerizada, com voltagem de 90 V. Posteriormente, este gel foi incubado com tampão citrato-fosfato 50 mM pH 7,0 por 1 hora a 60 °C, e corado com Coomassie Brilliant Blue R-250 0,1% dissolvido em etanol:ácido acético:água (30:7:63). A atividade de proteases foi visualizada como bandas claras no gel. O sulfato de amônio precipitou as proteases a 60% de saturação. Desta forma, um "pool" foi feito com os precipitados 60 e 70% para garantir maior presença destas enzimas. A temperatura de 60 °C e os valores de pH 7,0 e 11,0 resultaram em maior atividade de proteases, sendo que em pH 8,0 também foi observada alta atividade proteolítica. PMSF inibiu completamente a atividade das proteases, indicando que todas as proteases presentes no precipitado são serino proteases. EDTA e β-mercaptoetanol não tiveram efeito na atividade enzimática. Duas bandas foram observadas no zimograma, evidenciando a presença de duas proteases no látex de E. milii. É possível observar que uma das proteases está presente em maior quantidade do que a outra e que esta possui maior peso molecular, devido à maior espessura da banda localizada mais acima no gel. Desta forma, conclui-se que há duas serino proteases distintas presentes no látex de E. milii. |
| Palavras-chave | Protease, Euphorbia milii, Látex |
| Forma de apresentação..... | Painel |