Resumo |
A sobrevivência de organismos vegetais está sujeita a adaptações desencadeadas por diversas condições ambientais e, para que isto ocorra, mecanismos de regulação da expressão gênica são constantemente ativados por meio de vias de sinalização celular. Assim, o estudo de tais adaptações é essencial para a obtenção de plantas que sejam geneticamente aptas a tolerar estresses que representam detrimento à agricultura mundial. Dentre os possíveis estresses sofridos por plantas, estão os estresses osmóticos e no retículo endoplasmático, cujas respostas são moduladas pelo chaperone molecular BiP (binding immunoglobulin protein). Em convergência a estas duas respostas adaptativas, destaca-se o papel dos genes NRPs (codificantes de proteínas ricas em asparagina), responsáveis por atuar no processo de morte celular programada. A via de sinalização mediada por NRPs e seus respectivos domínios de morte celular (DCD) é conservada entre espécies e pode ser modulada negativamente pelo chaperone BiP, enquanto que subunidades da proteína trimérica G possivelmente constituem reguladores positivos da respectiva via de sinalização.. Reguladores de sinalização de proteína G (RGS) são conhecidos por acelerar a atividade GTPase exercida pela subunidade Gα da proteína heterotrimérica, presente também na membrana do RE e possivelmente responsável pelo trânsito de informações do RE para núcleo na via NRP/DCD. Tem sido demonstrado, em Arabidopsis thaliana, que a fosfolipase Dα1 (PLDα1), assim como RGS1, tem papel fundamental na regulação da atividade GTPase e interage com Gα e Gβ, um possível componente upstream à NRP na via de resposta a estresses, formando um complexo protéico responsável pela especificidade de sinal e plasticidade das interações nas células vegetais. Sabe-se também que, similarmente a superexpressão de BiP, a superexpressão de RGS1 resulta em plantas tolerantes ao estresse hídrico. Desta forma, o trabalho visa compreender, em Arabidopsis thaliana, mecanismos de resposta a diferentes tipos de estresses abióticos envolvendo as subunidades de proteínas G heterotriméricas e seus moduladores, as proteínas RGS1 e PLDα1. Utilizando o sistema de clonagem Gateway, RGS1 foi clonada em vetor binário para expressão em plantas, pK7FWG2, possibilitando a realização do ensaio de expressão transiente da proteína fusionada à GFP em Nicotiana benthamiana. A localização subcelular foi determinada através de microscopia confocal, confirmando ser uma proteína de membrana. A clonagem também foi realizada em vetores de expressão em levedura pDEST22 e pDEST32 para utilização em futuros ensaios de duplo-híbrido. |