Do Lógico ao Abstrato: A Ciência no Cotidiano
23 a 28 de outubro de 2017
Trabalho 8340
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | Outros |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | Outros |
| Primeiro autor | Adriele Jéssica do Carmo |
| Orientador | MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO |
| Outros membros | Guilherme Gabriel Souza Arthuso, Mariana Medeiros Costa, Mateus Gandra Campos |
| Título | Avaliação do potencial de aplicação do polipeptídeo auto-clivante em sistema procariótico de Escherichia coli como alternativa para expressão bicistrônica de proteínas recombinantes |
| Resumo | Uma sequência de cerca de 20 aminoácidos presente nos picornavírus, apresenta características estruturais e funções homólogas dentre os vários membros desta família. Esse polipeptídeo, ao ser sintetizado, desencadeia um evento denominado "stop-carry on", onde o peptídeo nascente interage com o túnel de saída do ribossomo para ditar uma parada na tradução independente do códon. Posteriormente, a tradução reinicia no mesmo códon e, assim, duas proteínas individuais são geradas a partir de um único quadro de leitura. O polipeptídeo denominado auto-processante tem mostrado ser uma alternativa para co-expressão de várias proteínas em um único quadro de leitura. Inicialmente, esse mecanismo foi descrito em células de mamíferos, que são os tipos celulares naturalmente infectados por esses vírus. Recentes estudos mostraram que esse mecanismo apresenta característica semelhante em células de inseto e levedura, porém não se tem relatos dessa funcionalidade em células procariotas. No presente trabalho, a sequência polinucleotídica auto-clivante presente no vírus da Febre Aftosa foi otimizada para o sistema procarioto e sua funcionalidade foi avaliada em sistema de Escherichia coli. Por meio de técnicas de biologia molecular como PCR e clonagem, foi construído um cassete de expressão contendo a região codificadora de uma proteína capsidial do vírus da Febre Aftosa (VP) seguida pela sequência codificadora da proteína auto-clivante (PAC). A cassete de expressão VP-PCR foi subclonada no vetor pET28a(+) contendo a sequência codificadora de uma proteína quinase fosforilada (PQF). Essa proteína pode controlar o splicing de mRNA em parasita, formando, assim, a cassete bicistrônica HIS-VP-PAC-HIS-PQF. O vetor contendo o cassete foi, então, inserido em células de E. coli do tipo BL21 para análise da expressão das proteínas recombinantes. A construção do cassete bicistrônico contendo as regiões codificantes de HIS-VP-PAC-HIS-PQF foi confirmada por sequenciamento e PCR. Os ensaios de indução mostraram que as melhores condições foram cultivadas em meio Luria-Bertaini líquido 37°C a 180 rpm, com 0,25 mM de indutor (IPTG). Nos intervalos de 2 a 19 horas de indução a produção proteica se manteve constante. Além disso, verificou-se que a proteína é expressa na forma insolúvel, ou seja, foi encontrada apenas nos corpos de inclusão. Os ensaios de SDS-PAGE e western blotting permitiram verificar três bandas proteicas em alturas características do conjunto VP-PAC-HIS-PQF (proteínas não clivadas) e VP-PAC e PQF. Os resultados permitiram concluir que a atividade "stop-carry on" da proteína auto-clivante também ocorre em organismos procariotos, porém é notório que sua função não ocorre na totalidade das proteínas expressas. Os resultados aqui obtidos irão melhorar os processos de produção de proteínas recombinantes. Contudo, outras pesquisas que sejam capazes de verificar a eficácia desse processo devem ser consideradas antes que esse sistema seja implementado como estratégia. |
| Palavras-chave | Proteína auto-clivante, expressão, construção bicistrônica |
| Forma de apresentação..... | Oral, Painel |