Conexão de Saberes e Mundialização
19 a 24 de outubro de 2015
Trabalho 5127
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Biotecnologia |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PIBITI/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CNPq |
| Primeiro autor | Anna Paula Souza Fonseca |
| Orientador | MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO |
| Outros membros | Luiz Fernando Lino de Souza, Natalia Fialho Gonzaga, Thiago Souza Onofre |
| Título | Otimização da técnica de qPCR para quantificação viral do Porcine Circovirus 2 |
| Resumo | O aumento da preocupação com doenças infecciosas em suínos vem tomando novas proporções, principalmente na década de 90, quando surgiu um novo vírus denominado Porcine cirvovirus 2 (PCV2), relacionado com algumas síndromes, responsáveis por doenças conhecidas como Doenças Associadas ao Porcine circovirus 2 (PCVADs). A técnica de PCR em tempo real mostrou ser eficiente e precisa no diagnóstico de doenças causados por vírus. A padronização do protocolo de PCR em tempo real garante a obtenção de resultados confiáveis e evita problemas relacionados a execução da técnica como baixa eficiência na etapa de amplificação, surgimento de produtos inespecíficos, impurezas presentes na amostra, assim como falsos positivos e negativos. Construiu-se uma curva padrão com diluições seriadas conhecidas para estimar o número de cópias virais por µL por meio de comparações com uma amostra conhecida. Foi utilizada uma amostra de plasmídeo recombinante que continha o genoma completo do Porcine circovirus-2 (PCV2). O DNA plasmidial foi extraído utilizando o kit GeneJET® Plasmid miniprep e quantificado espectrofotometricamente. A partir da quantificação do inserto e vetor vs. a concentração obtida em ng/µL, foi determinada o número de cópias virais. O volume inicial foi diluído na proporção 1:8 para obtenção da diluição inicial que foi de 1x109 cópias/µL. Foram feitas diluições seriadas até o limite inferior de 1x102 cópias/µL. Para a otimização da reação, os oligonucleotídeos antisenso, senso e sonda, foram diluídos em diferentes concentrações variando de 50, 300 e 900 nM e 150, 200 e 250 nM, respectivamente. A amplificação consistiu de 2 minutos a 50 °C, 10 minutos a 95 °C e 40 ciclos de 15 segundos a 95° C e 1 minuto a 60 °C. Em cada curva de amplificação, calculou-se o valor de Ct (threshold cycle). Para verificar a eficiência da reação, gerou-se um gráfico de análise por regressão linear a partir do valores de Ct da curva. A otimização da reação demonstrou a melhor eficiência com as concentrações de 300nM de oligonucleotídeo senso, 900nM de oligonucleotídeo antisenso e 250nM de sonda, 12,5µL de master mix (Applied Biosystems) num volume final de reação de 25µL. Os controles negativos demonstraram Ct indeterminado. Posteriormente, verificou-se todos os pontos da curva de 1x109 até 1x102. As médias dos valores de Ct variaram de 12,5 a 34,8 respectivamente. Amostras provenientes da curva padrão e de soro de animais naturalmente infectados foram testadas e alguns parâmetros analíticos do ensaio foram avaliados. Concluiu-se que a construção da curva padrão, a verificação da eficiência da reação e as análises para se avaliar os parâmetros analíticos, são etapas essenciais para realização de quantificação absoluta por qPCR. |
| Palavras-chave | Padronização, qPCR, PCV2 |
| Forma de apresentação..... | Painel |