Conexão de Saberes e Mundialização
19 a 24 de outubro de 2015
Trabalho 4849
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Farmacologia e bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | FAPEMIG |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Joice de Melo Agripino |
| Orientador | JULIANA LOPES RANGEL FIETTO |
| Outros membros | GUSTAVO COSTA BRESSAN, MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO, Matheus Silva e Bastos, Myrian Augusta Araujo Neves do Valle |
| Título | Expressão, purificação e caracterização das E-NTPDases de Leishmania infantum chagasi e análise da interferência das recombinantes na infecção de macrófagos. |
| Resumo | As E-NTPDases são enzimas da família das apirases com habilidade de hidrolisar nucleotídeos trifosfatados até a sua forma monofosfatada, sendo dependentes de íons bivalentes, como cálcio e magnésio. As E-NTPDases caracterizam-se pela presença de cinco regiões altamente conservadas entre as diferentes isoformas, denominadas ACRs (apyrase conserved regions) que são regiões importantes para a atividade catalítica. Em tripanossomatídeos, as E-NTPDases tem papel fundamental na via de salvação de purinas, visto que esses parasitos não possuem a capacidade de realizar síntese “de novo” de nucleosídeos. Além disto, os nucleotídeos extracelulares são sinalizadores celulares em diversos eventos, como a regulação do sistema imune de mamíferos, atuando sobre receptores purinérgicos e pirimidinérgicos. Neste projeto o objetivo geral é avaliar o papel das E-NTPDases 1 e 2 na interação Leishmania-célula hospedeira gerando dados específicos sobre a atividade enzimática das enzimas recombinantes e sobre a participação dessas enzimas na infecção in vitro de macrófagos, o que possibilitará maior compreensão sobre o mecanismo de ação dessa enzima e sua participação no processo de infecção de macrófagos. O sistema de expressão heterólogo utilizado foi o em E.coli com fusão à uma cauda de hexa-histidina na porção C-terminal da proteína recombinante, o que possibilita a purificação das proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade. Ao longo do projeto, um protocolo de cromatografia adicional foi padronizado, sendo aplicado após a realização da purificação por afinidade das enzimas recombinantes a fim de eliminar lipopolissacarídeos (LPS) contaminantes existentes nas amostras de proteína purificadas. Esta metodologia adicional foi necessária já que diversos dados na literatura mostram o efeito do LPS na ativação de macrófagos, o que poderia interferir nos ensaios de infecção. As proteínas recombinantes foram analisadas em gel de poliacrilamida, quantificadas e o ensaio de atividade enzimática foi feito antes e depois deste passo cromatográfico adicional, utilizando tampão de renaturação com glutationa em pH 8,0 tendo como substrato da reação GDP. Nas quantificações realizadas foi possível observar perda de proteína ao longo do processo de purificação. Nos ensaios realizados com as proteínas recombinantes e com os parasitos foi avaliado o efeito das E-NTPDases 1 e 2 no processo de infecção de macrófagos RAW 264.7, mais especificamente a interferência das proteínas recombinantes (1 e 3 µg de proteína/poço) no processo de adesão do parasito no hospedeiro. E na presença das proteínas recombinantes ocorreu a diminuição do número de parasitos aderidos na superfície do macrófago. O que mostra a interferência das E-NTPDases sobre o processo de interação parasito-hospedeiro, abrindo espaço para mais estudos acerca da participação dessas enzimas no processo de infecção. |
| Palavras-chave | Expressão heteróloga, E-NTPDases, Leishmania infantum chagasi |
| Forma de apresentação..... | Painel |