Conexão de Saberes e Mundialização
19 a 24 de outubro de 2015
Trabalho 4761
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Biotecnologia |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG, FUNARBE |
| Primeiro autor | Leilane Ferreira Teixeira |
| Orientador | GUSTAVO COSTA BRESSAN |
| Outros membros | Éverton de Almeida Alves Barbosa, Rafael Locatelli Salgado, Thiago Souza Onofre |
| Título | Clonagem, expressão e purificação da cinase reguladora de splicing PfSRPK1 de Plasmodium falciparum |
| Resumo | A progressão do ciclo de vida do P. falciparum, agente etiológico da malária, durante a fase sexuada depende da maquinaria de splicing, processo no qual a cinase reguladora PfSRPK1 desempenha papel-chave. O desenvolvimento do gametócito masculino do parasito está atrelado à atividade desta cinase. Dessa forma, essa enzima evidencia-se como um alvo terapêutico promissor para o desenvolvimento de novos fármacos cuja síntese é racionalmente dirigida. Sabe-se de antemão que uma forma truncada da enzima é cataliticamente ativa, posto isso, o presente trabalho teve por objetivos clonar a construção truncada em sistema de expressão heteróloga procariótico e produzir a proteína na forma solúvel para posterior purificação em coluna de afinidade. O cDNA codificante para a forma truncada de PfSRPK1 foi clonado no vetor de expressão pET28-a, utilizando as enzimas de restrição SalI e HindIII. A partir de cepas de Escherichia coli BL21 (DE3) RIL transformadas com o cassete gênico a expressão foi padronizada testando-se duas concentrações (0,25 mM ou 0,5 mM) do agente indutor de expressão Isopropil-β-D-Galactosídeo (IPTG) após a cultura atingir a fase de crescimento exponencial. Após 0h, 1h, 2h, 3h e 4h de indução, a presença da proteína recombinante foi verificada no extrato bacteriano por SDS-PAGE 15% e Western blot tanto para a fração solúvel como na insolúvel. A enzima foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna carregada com níquel acoplada ao sistema FPLC. As quantidades de proteína induzidas em ambas as concentrações de IPTG testadas foram equivalentes. Houve uma expressão basal no tempo 0h. Com 1h de indução a proteína estava presente em maior concentração na fração solúvel e, com o passar do tempo, a expressão foi maior na fração insolúvel. No processo de purificação, verificou-se que a eluição da proteína ocorre com aproximadamente 100 mM de imidazol e em duas frações, sendo uma com menor grau de pureza e outra mais pura. Portanto, a produção heteróloga da enzima foi padronizada e a abordagem experimental foi capaz de fornecê-la em concentração e pureza suficientes para realizar ensaios subsequentes. |
| Palavras-chave | Cinase, Splicing, Plasmodium |
| Forma de apresentação..... | Painel |