Conexão de Saberes e Mundialização
19 a 24 de outubro de 2015
Trabalho 4565
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Biotecnologia |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | PIBITI/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Maria Isabella Petra Souza |
| Orientador | VALERIA MONTEZE GUIMARAES |
| Outros membros | Ana Maria dos Santos Camargos, Rafaela Zandonade Ventorim |
| Título | Mutagênese sítio-dirigida da xilanase XynA de Orpinomyces sp. PC-2 para aumento da termoestabilidade |
| Resumo | As xilanases são glicosil hidrolases que catalisam a hidrólise aleatória de ligações glicosídicas β-1,4 internas da xilana com a formação de xilo-oligossacarídios solúveis e têm sido utilizadas para várias aplicações biotecnológicas. No entanto, essas enzimas normalmente não apresentam propriedades adequadas às condições dos processos industriais. Nesse trabalho, a técnica de mutagênese sítio-dirigida foi empregada com o propósito de obter xilanases mutantes, derivadas do gene xynA de Orpinomyces, mais estáveis. As xilanases SXWT e SXM (V108A; A199T) foram utilizadas como molde para a deleção de resíduos de aminoácidos específicos (G10, T30, N53, Q109 e G110) em regiões flexíveis da estrutura da xilanase, identificados por modelagem e dinâmica molecular, a fim de aumentar a estabilidade. Oito enzimas mutantes foram obtidas: SXWT-G10, SXWT-T30, SXWT-N53, SXWT-Q109/G110, SXM-G10, SXM-T30, SXM-N53 e SXM-Q109/G110. Após a confirmação das deleções, E. coli BL21 (DE3) RIPL foi transformada para superexpressão das enzimas. A concentração de IPTG de 0,25 mM promoveu a melhor produção das xilanases solúveis e ativas, resultando em valores de atividade entre 1.500 - 9.200 U.mg-1 de proteína. As xilanases mutantes SXWT; SXWT-G10, SXWT-T30, SXWT-N53 e SXWT-Q109/G110, avaliadas quanto ao efeito das deleções na estabilidade térmica, exibiram valores de meia-vida a 60 °C de 5,8; 7,4; 10,1; 5,6; e 8,4 min, respectivamente; e 11,1; 5,8; 22,5; 7,0; e 11,8 min para SXM, SXM-G10, SXM-T30, SXM-N53 e SXM-Q109/G110, respectivamente. Após purificação por cromatografia de troca iônica, o grau de pureza dos extratos enzimáticos foi avaliado por SDS-PAGE. As enzimas apresentaram maior atividade na faixa de 40 - 60 °C e pH 4 - 8. Os valores de KM das xilanases variaram de 0,21 - 2,53 g.L-1. Dentre as xilanases obtidas, SXWT-T30 e SXM-T30 destacaram-se devido ao aumento na estabilidade térmica sem comprometer a atividade, indicando que a mutagênese sítio-dirigida foi eficiente na obtenção de novos mutantes com potencial para aplicações biotecnológicas. |
| Palavras-chave | Mutagênese sítio-dirigida, xilanase, estabilidade |
| Forma de apresentação..... | Oral |