Ciência e Tecnologia: bases para o Desenvolvimento Social
20 a 25 de outubro de 2014
Trabalho 3409
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Microbiologia |
| Setor | Departamento de Veterinária |
| Bolsa | PIBIC/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CNPq |
| Primeiro autor | Jéssica Lelis de Miranda |
| Orientador | ABELARDO SILVA JUNIOR |
| Outros membros | Otávio Valério de Carvalho |
| Título | Construção de Plasmídeos com Sistema de Expressão de RNA de Interferência para Silenciamento Gênico do Vírus da Cinomose Canina |
| Resumo | Buscando novas estratégias para a terapia contra o vírus da cinomose canina, o silenciamento gênico por RNA de interferência foi eleito como uma alternativa promissora, baseando-se em estudos com outros agentes, como o vírus da raiva e o vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV). A cinomose é uma doença importante no Brasil e no mundo, com mortalidade e incidência elevadas, cujos sinais clínicos variam ente sinais respiratórios, gastrointestinais, dermatológicos e neurológicos. Não existe tratamento específico para essa enfermidade e apesar da vacinação extensiva, são comuns surtos da doença. Desse modo, o grupo de pesquisa está desenvolvendo uma ferramenta terapêutica baseada no silenciamento gênico do canine distemper virus (CDV) para inibir etapas específicas da replicação viral e combater a infecção no hospedeiro. O isolamento viral foi realizado em cultivo de células VERODogSlamtag a partir de amostras biológicas coletadas de animais no Hospital Veterinário – UFV. A extração de RNA e síntese de cDNA viabilizaram a PCR para confirmação do vírus e PCR em tempo real (RT-qPCR) para quantificação viral. Outros métodos realizados foram a purificação dos produtos de PCR para clonagem no vetor pGEM T-easy para posterior ensaio de restrição e transcrição in vitro, com a finalidade de construir uma curva padrão utilizada no RT-qPCR. Também foram realizados o desenho e síntese de oligos RNA fita simples (shRNA) e o anelamento destas para obtenção de RNA de fita dupla (ds oligos), que foram utilizados na clonagem no vetor pENTR/U6. Duas amostras de campo foram isoladas, a partir da visualização do efeito citopático esperado e confirmação no PCR e RT-qPCR. O anelamento apresentou 50% de eficiência, conforme rendimento citado no kit. A transformação dos plasmídeos clonados ocorreu na E.coli TOP10 quimicamente competente. Comparando o vetor pGEM T-easy e o vetor pENTR/U6, o primeiro apresentou maior eficiência na clonagem e transformação. O ensaio de restrição e o PCR de colônias dos clones pENTR/U6 não apresentaram os resultados esperados, inviabilizando a confirmação indireta da presença do inserto. Ainda assim, foi feito miniprep de várias colônias para purificação dos plasmídeos e essas amostras foram enviadas para sequenciamento em duas empresas diferentes. Os sequenciamentos apresentaram baixa qualidade e até o presente momento não houve confirmação da clonagem no pENTR/U6. No entanto, algumas dificuldades relativas ao sequenciamento do pENTR/U6 estão relatadas no manual e novas tentativas serão realizadas com o apoio técnico do fabricante. |
| Palavras-chave | cinomose, RNA de interferência, silenciamento gênico |
| Forma de apresentação..... | Painel |