Ciência e Tecnologia: bases para o Desenvolvimento Social
20 a 25 de outubro de 2014
Trabalho 3318
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Farmacologia e bioquímica |
| Setor | Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular |
| Bolsa | CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Primeiro autor | Izadora Lorrany Alves Rabelo |
| Orientador | JULIANA LOPES RANGEL FIETTO |
| Outros membros | Joice de Melo Agripino, MARCIA ROGERIA DE ALMEIDA LAMEGO, Matheus Silva e Bastos |
| Título | Avaliação da participação das E-NTPDases no processo de infecção dos macrófagos J774 e RAW 264.7 por Leishmania infantum chagasi |
| Resumo | Introdução: A ativação do ATP extracelular possui múltiplos efeitos em macrófagos, tal como o controle de citocinas e aumento na morte de parasitos infectantes. Sabe-se que as enzimas NTPDases 1 e 2 são importantes no processo infeccioso por parasitos do gênero Leishmania. Portanto, a determinação dos receptores envolvidos na infecção de macrófagos é essencial para o entendimento e controle dos mecanismos de infecção por Leishmania. Objetivos: Avaliar a participação das NTPDases 1 e 2 recombinantes de L. infantum chagasi na infecção in vitro de macrófagos JJ74 e RAW por L. infantum chagasi pela quantificação da sensibilização por ATP de receptores do tipo canal em macrófagos e internalização dos parasitos. Material e métodos: O Ensaio de ativação de receptores foi feito utilizando 1µg total das enzimas recombinantes pré-purificadas com incubações (mesmas condições de cultura) por 24h e 2h e re-adição das enzimas por 10min em 5 x 105 macrófagos/poço. Foi testada a sensibilização dos receptores tipo canal com 1mM e 3mM de ATP adicionados após as enzimas por 10min e adição de Brometo de Etídio para quantificação da fluorescência a 530/25 e 645/40. O ensaio de infecção in vitro se procedeu em lamínulas circulares com 1,25 x 105 macrófagos RAW/poço e RPMI suplementado incubadas por 24h. Ambas as enzimas pré-purificadas renaturadas e pré-purificadas desnaturadas à 80-85°C foram testadas, sendo os controles: enzima teste, tampão de renaturação, tampão da enzima teste e BSA. A infecção prosseguiu com 3,75 x 105 de formas promastigotas metacíclicas de L. infantum chagasi incubadas por 3h e 72h, com posterior coleta do sobrenadante para dosagem de citocinas. Por fim, determinação do parasitismo por microscopia após preparação das lâminas. Resultados e Conclusões: A presença das NTPDases com ambos 1 e 3mM de ATP diminuiu a entrada de brometo nas células, sugerindo que a sensibilização dos canais é dependente de uma quantidade maior de ATP. Com a adição das enzimas recombinantes pré-purificadas percebeu-se que somente a NTPDase2 não aumentou a infecção, sugerindo que a estrutura da mesma pode ser importante para o processo. A adição das enzimas isoladas após purificação aumentou a infecção, mas não houve diferença significativa no padrão de infecção quando ambas desnaturadas estavam presentes. Portanto, a determinação de quais receptores estão envolvidos na infecção se faz ainda necessária, uma vez que diferenças no padrão de entrada de brometo sugerem reais diferenças na sensibilização dos receptores por ATP. E pelos testes de infecção percebeu-se que as enzimas renaturadas individualmente aumentam significativamente a internalização de parasitos, confirmando a importância destas no processo de infecção de macrófagos in vitro. |
| Palavras-chave | E-NTPDase, Leishmania, Infecção |
| Forma de apresentação..... | Painel |