Ciência e Tecnologia: bases para o Desenvolvimento Social
20 a 25 de outubro de 2014
Trabalho 2351
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Genética e melhoramento vegetal |
| Setor | Departamento de Biologia Geral |
| Bolsa | PIBIC/CNPq |
| Conclusão de bolsa | Sim |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG |
| Primeiro autor | Kassiana Mafra Bicalho |
| Orientador | CARLOS ROBERTO DE CARVALHO |
| Outros membros | Guilherme Mendes de Almeida Carvalho, Thaís Cristina Ribeiro da Silva |
| Título | Estabelecimento de metodologia de ensaio cometa para avaliação de fragmentação de DNA nuclear em calos de Passiflora cincinnata |
| Resumo | A embriogênese somática (ES) é um importante processo usado na cultura de tecidos vegetais e pode ser do tipo direta (ESD) ou indireta (ESI). Na ESI, células somáticas sofrem desdiferenciação, formam uma massa de células indiferenciadas denominada calo e, posteriormente, rediferenciam-se em embriões. Devido ao esgotamento de nutrientes, ao tempo de subcultivo e à presença de reguladores de crescimento, a ES expõe as células a condições de estresse, que podem levar à variação somaclonal ou a danos físicos na própria estrutura da molécula de DNA. O ensaio cometa permite a identificação de quebras de DNA em células individuais através da combinação de eletroforese em células embebidas em agarose e microscopia de fluorescência. Apesar de ser uma importante ferramenta em estudos de genotoxicidade e biomonitoramento, poucos trabalhos foram desenvolvidos aplicando o ensaio cometa ao cultivo in vitro. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma metodologia, com especial enfoque no isolamento nuclear, para o uso do ensaio cometa em calos. Procurou-se também avaliar os danos no DNA em relação aos tempos de subcultivo e às camadas verticais dos calos. Por apresentar níveis seguros de respostas morfogênicas in vitro, a espécie Passiflora cincinnata foi utilizada no estudo. Folhas cotiledonares foram utilizadas como explante para a indução de embriogênese e consequente formação de calos. Para o isolamento nuclear, 0,2 g de um dos calos, mantido no meio de indução por 6 meses, foi submetido a cortes sucessivos em tampão de isolamento nuclear. Três tampões foram testados: PBS, Tris e Sorensen. A suspensão nuclear foi filtrada e 22 µL desta foram misturados à 88 µL de agarose low melting (0,75%) em uma lâmina previamente coberta com agarose normal melting (1%). As lâminas, cobertas com uma lamínula, foram mantidas a 4°C por 20 min e, após este período, as lamínulas foram retiradas. Para o desenovelamento, as lâminas fora incubadas em solução alcalina por 5 min. A eletroforese foi executada em mesma solução a 0,8V/cm por 18 min. Após eletroforese, as lâminas foram neutralizadas e coradas com acridina orange. Para as análises dos eventuais danos entre os diferentes tempos e entre as camadas, o mesmo procedimento foi utilizado aplicando-se o melhor tampão obtido no teste anterior. O PBS foi considerado o melhor tampão para isolamento pois permitiu a obtenção de um maior número de núcleos em relação aos outros tampões. O isolamento mecânico também foi eficiente no isolamento nuclear. Observou-se que os danos na molécula de DNA do genoma nuclear independe da idade ou camadas do calo, sugerindo que esta relação seja calo-específica. Mediante os resultados obtidos, foi possível também padronizar uma metodologia para ensaio cometa utilizando-se material calogênico, o que possibilitará a condução de futuros trabalhos em calos de P. cincinnata |
| Palavras-chave | Passiflora cincinnata, embriogênese somática, ensaio cometa |
| Forma de apresentação..... | Oral |