Ciência e Tecnologia: bases para o Desenvolvimento Social
20 a 25 de outubro de 2014
Trabalho 2282
| ISSN | 2237-9045 |
|---|---|
| Instituição | Universidade Federal de Viçosa |
| Nível | Graduação |
| Modalidade | Pesquisa |
| Área de conhecimento | Ciências Biológicas e da Saúde |
| Área temática | Genética e melhoramento vegetal |
| Setor | Departamento de Biologia Geral |
| Bolsa | PROBIC/FAPEMIG |
| Conclusão de bolsa | Não |
| Apoio financeiro | CAPES, CNPq, FAPEMIG, FUNARBE |
| Primeiro autor | Gabriella Macedo Mascarenhas Diniz |
| Orientador | CARLOS ROBERTO DE CARVALHO |
| Título | Adaptação do protocolo de citometria de fluxo para extração nuclear e analise de ploidia |
| Resumo | O gênero Eucalyptus tem grande importância econômica e ambiental em virtude de sua capacidade de adaptação a diversas condições de clima e solo, além de apresentar rápido crescimento e servir como matéria prima para uma grande diversidade de produtos industriais de alto valor econômico. Considerando a sua importância, várias técnicas de biotecnologia têm sido aplicadas para gerar dados passíveis de utilização em programas de melhoramento vegetal. Dentro dessas técnicas, a poliploidização tem recentemente sido considerada uma ferramenta de interesse e investimento, considerando que plantas induzidas à poliploidia demonstram diversas características que superam as apresentadas pelo indivíduo diplóide. A citometria de fluxo (CF) é uma técnica de grande auxílio na prospecção rápida e precoce da ploidia de grande número de indivíduos induzidos à poliploidização. Para essa técnica ter eficiência e precisão, o protocolo deve possibilitar a obtenção de núcleos isolados, viáveis e em condições de coloração estequiométrica adequada com fluorocromos específicos. Considerando as características particulares de cada planta, os procedimentos de obtenção da suspensão nuclear para CF devem ser adequados individualmente. As folhas de Eucalyptus spp. possuem grande quantidade de compostos secundários que oxidam rapidamente a amostra e dificultam a obtenção de resultados satisfatórios em análises citométricas. O objetivo do presente trabalho consistiu em adaptar a metodologia de extração nuclear visando o seu processamento mais adequado e informativo etapas subsequentes da CF. As plantas de eucalipto utilizadas no experimento foram cultivadas em casa de vegetação na Universidade Federal de Viçosa. Fragmentos de 2 cm2 de folhas jovens foram fragmentadas in placas de petri contendo tampão OTTO I, suplementado com DTT 2 mM e 0,5% DMSO. Visando a otimização do protocolo, diferentes tempos de incubação no tampão de lise e de ciclos de homogeneizações em vortex foram testados. O tempo de incubação testado no tampão variou de 5, 10, 15, 20 e 30 min, com homogeneizações de ciclo de 20 seg a cada 5 min. O experimento foi realizado com três repetições. Após o tratamento, a suspensão nuclear resultante foi filtrada em uma malha de 30 µm e centrifugada a 1100 rpm por 5 min. O sobrenadante foi descartado e 100 µl de OTTO I foi acrescentado ao pellet por 10 min. Ao final, 1,5 µl da solução de coloração OTTO II suplementada com 15 µM DAPI e 2 mM DTT foi adicionado, mantido no escuro por 20 min para corar. A análise dos tratamentos demonstrou que o tempo de incubação ótimo foi de 15 min com 3 ciclos de homogeneizações, gerando o menor coeficiente de variação (CV=3,5%). Esse protocolo adaptado possibilita análises de um grande número de plantas de eucalipto com precisão, fornecendo informações de confiabilidade para a tomada de decisão dentro de experimentos realizados pela empresas florestais. |
| Palavras-chave | Protocolo, Citometria de Fluxo, Eucalyptus spp.. |
| Forma de apresentação..... | Painel |